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蛋白樣品制備詳解—酶類篇
閱讀：1813發(fā)布時間：2021-9-16
當細胞破碎的時候，蛋白水解酶就會被釋放出來或被激活，使電泳結(jié)果復雜化，影響最終結(jié)果分析。為了避免這些情況的出現(xiàn)，建議在樣品制備時盡可能在低溫下進行。此外，許多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時應當使用蛋白酶抑制劑。因此對于我們想要研究的蛋白來說，選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對于蛋白純化路線設(shè)計來說顯得尤為重要。
蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣，都是紛繁復雜的，通常使用許多化學物質(zhì)作為蛋白酶抑制劑，如PMSF 和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對某一類蛋白酶起作用，因此通常建議復合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒"。
但是這樣配置溶液進行處理，有時也是頗為麻煩，而且效果可能并不好，目前有一些廠家試劑在簡便操作，和抑制效果方面有不俗的表現(xiàn)，可以考慮在實驗中選用，節(jié)約時間和便于結(jié)果分析。
比如，G-Biosciences的ProteaseArrest™蛋白酶抑制劑也許就能滿足這種需要，ProteaseArrest™是一種常規(guī)的蛋白酶抑制劑混合物，提供100X濃縮的即用溶液。這種100X濃度的溶液適用于小量，分析樣本的應用。在1ml樣本中加入10微升的ProteaseArrest可以達到大于95%的抑制效率。對于樣本中含量高的蛋白酶的情況，可以適當增加ProteaseArrest的量來達到更大的抑制效率。
抑制劑混合物包括針對絲氨酸、半胱氨酸、鈣蛋白酶和金屬蛋白酶可實現(xiàn)可逆和不可逆的抑制。可選擇的EDTA的溶液可實現(xiàn)增強的金屬蛋白酶的抑制。EDTA并不存在于ProteaseArrest混合物溶液中，它將抑制那些需要二價陽離子（Ca2+, Mg2+ 或Mn2+）來起作用的蛋白質(zhì)的活性。除此之外，EDTA會抑制那些通過使用固定金屬親和層析色譜純化得到的蛋白，也包括6XHis標簽重組蛋白。
由于各種抑制劑組分的*化的濃度，ProteaseArrest表現(xiàn)出優(yōu)異的蛋白酶活性的抑制，因而它適合在從動物組織，酵母，植物和細菌中進行蛋白純化和樣本制備過程中來保護蛋白。
ProteaseArrest也有獨立包裝的小包裝，能夠在10ml的溶液中達到大于95%的抑制效率。這種OneQuant™小包裝主要是為了科研人員方便使用。
實重要的是ProteaseArrest也可以根據(jù)實驗的情況來優(yōu)化蛋白酶抑制劑的濃度，比如組織中含有高于常規(guī)量的蛋白酶的時候，可以加入2X或者更高濃度的ProteaseArrest的量。
在研究中，發(fā)現(xiàn)1X濃度的ProteaseArrest的蛋白酶抑制效率達到了95%（0.5mg/ml的小鼠的胰腺提取物為例）。
除了蛋白酶抑制劑以外，在許多研究過程中，尤其是一些制藥公司和研究院在研究藥理學機制的時候，需要了解蛋白磷酸化途徑，因此一個重要的步驟就是準確的觀察一般和特異的磷酸化狀態(tài)，所以蛋白抽提的另一個重要保護過程就是對磷酸化狀態(tài)的有效保護。
磷酸化的蛋白可以被非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶），特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或雙重特異性磷酸酶去磷酸化。針對這種情況G-Biosciences也推出了一種PhosphataseArrest™磷酸酶抑制劑混合物，它能夠保持細胞和組織中蛋白的磷酸化狀態(tài)。PhosphataseArrest™包括3種抑制劑產(chǎn)品。
phosphataseArrest™ I
一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶抑制劑，能夠特異性的抑制絲氨酸/蘇氨酸，和酪氨酸雙重特異性的磷酸酶。PhosphataseArrest™ I是一種穩(wěn)定的溶液組成，含有氟化鈉，正釩酸鈉，焦磷酸鈉，β-磷酸甘油，鉬酸鹽等。
磷酸酶抑制劑 | 分子量 | 靶向磷酸酶 |
氟化鈉 | 42 | 酸性磷酸酶 |
正釩酸鈉 | 183.9 | 酪氨酸磷酸酶，堿性磷酸酶 |
焦磷酸鈉 | 221.94 | 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
β-磷酸甘油 | 306.1 | 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
鉬酸鹽 | 205.92 | 酸性磷酸酶 |
PhosphataseArrest™ II
一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶的抑制劑能夠抑制酸性，堿性和酪氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ II含有優(yōu)化濃度的氟化鈉，酒石酸鈉，正釩酸鈉，咪唑和鉬酸鹽。
磷酸酶抑制劑 | 分子量 | 靶向磷酸酶 |
氟化鈉 | 42 | 酸性磷酸酶 |
正釩酸鈉 | 183.9 | 酪氨酸磷酸酶，堿性磷酸酶 |
酒石酸鈉 | 230.08 | 酸性磷酸酶 |
咪唑 | 68.08 | 堿性磷酸酶 |
鉬酸鹽 | 205.92 | 酸性磷酸酶 |
PhosphataseArrest™ III
一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括3種磷酸酶的抑制劑能夠抑制堿性和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ III是一種穩(wěn)定的，方便的溶液，由斑蝥素，對溴四咪唑草酸鹽和腫瘤促進劑組成。
磷酸酶抑制劑 | 分子量 | 靶向磷酸酶 |
斑蝥素 | 196.2 | 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
對溴四咪唑草酸鹽 | 373.23 | 堿性磷酸酶 |
腫瘤促進劑 | 1009.17 | 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
總而言之，在實驗中適當?shù)倪x擇一些經(jīng)過嚴格的質(zhì)量監(jiān)控的產(chǎn)品，想來相比較于家制的雞尾酒而言具有更好的使用重復性，和有效性，讓我們在下游應用中得到更潔凈和清晰的結(jié)果。
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