液相色譜基礎(chǔ)知識詳解!
液相色譜是現(xiàn)在食品實驗室中應(yīng)用非常廣泛的一款儀器,但是還有很多小伙伴對它的原理、使用維護(hù)等知識不太了解。今天小編就從HPLC概述、工作原理、結(jié)構(gòu)組成、常見故障及維護(hù)、HPLC應(yīng)用等方面來給大家科普下HPLC的基礎(chǔ)知識。
1 液相色譜法概述
液相色譜法(HPLC)是上個世紀(jì)七十年代迅速發(fā)展起來的一項、快速的分析分離技術(shù),是現(xiàn)代分離測試的重要手段。色譜法的分離原理是:溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時,由于與固定相(station phase)發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同,在固定相中滯留時間不同,從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,其以液體作為流動相,并采用顆粒極細(xì)的固定相的柱色譜分離技術(shù)。其分離機(jī)制與常規(guī)柱色譜相同,但填料更加精細(xì),需高壓泵推動,柱效高,分析速度快。與氣相色譜不同的是液相色譜中流動相亦參與組分的分離過程,其組成、比例和pH值可靈活調(diào)節(jié),分離模式多樣。在實際操作中主要通過改變流動相的組成來調(diào)節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性,從而使不同樣品得到分離。
液相色譜法自20世紀(jì)60年代問世以來,由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測器,實現(xiàn)了對樣品的高速、和高靈敏度的分離測定。液相色譜由于吸取了經(jīng)典液相色譜的研制經(jīng)驗,并引入微處理機(jī)技術(shù),極大的提高了儀器的自動化水平和分析精度?,F(xiàn)在用微處理機(jī)控制的液相色譜儀,其自動化程度很高,既能控制儀器的操作參數(shù)(如溶劑梯度洗脫、流動相流量、柱溫、自動進(jìn)樣、洗脫液收集、檢測器功能等),又能對獲得的色譜圖進(jìn)行收縮、放大、疊加,以及對保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進(jìn)行處理等,為色譜分析工作者提供了率、功能齊全的分析工具。
液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛,對樣品的適用性廣,不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,幾乎所有的化合物包括高沸點、極性、離子型化合物和大分子物質(zhì)均可用液相色譜法分析測定,因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中,可用氣相色譜分析的約占20% ,而80% 則需用液相色譜來分析。HPLC因其具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析和分離高沸點且不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質(zhì)的特點而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物及臨床分析,世界各國己將該法收載于藥典。
火焰離子化檢測器、手性、化學(xué)發(fā)光、核磁共振、質(zhì)譜檢測器等新型檢測技術(shù)
GC與LC的比較
由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點限制,因此具有更廣闊的應(yīng)用潛力。經(jīng)過30多年的迅速發(fā)展,液相色譜法在基礎(chǔ)理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已趨于成熟,現(xiàn)已成為化學(xué)化工、環(huán)境、藥學(xué)、食品等多個領(lǐng)域中相當(dāng)有優(yōu)勢的分離分析方法之一。
2 基本原理
液相色譜根據(jù)分離機(jī)理的不同可分為:
¬液固吸附色譜
¬液液分配色譜
¬離子交換色譜
¬離子對色譜法
¬分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)
(一)液-固吸附色譜
流動相為液體,固定相為固體吸附劑,根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來分離物質(zhì)。
(二)液-液分配色譜
流動相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜,是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進(jìn)行分離。一種液相為流動相,另一種是涂于載體上的固定相。
流動相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法。
流動相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法。
(三)離子交換色譜
(四)離子對色譜法
(五)分子排阻色譜法
3 結(jié)構(gòu)組成
(1)泵的基本原理
(2)儀器:四元泵
(3)儀器:手動進(jìn)樣器——六通閥/定量環(huán)
(4)儀器:自動進(jìn)樣器
(5)色譜柱:柱溫箱、色譜柱外掛架
(6)儀器:檢測器——紫外
(7)儀器:化學(xué)工作站
(8)固定相與流動相
(9)流動相(反相)
4 常見故障及維護(hù)
4.1 HPLC對流動相的一般要求
流動相就比如人體的血液,其質(zhì)量直接影響到整個系統(tǒng)的正常運行與否。
應(yīng)該使用HPLC級的溶劑,不能互相混溶的溶劑不可以直接切換!一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時,使用異丙醇作為過渡溶劑。
注意溶劑的截止波長。截止波長是指該溶劑可以在紫外檢測器中使用的低波長,低于該波長后,溶劑會有很強(qiáng)的紫外吸收,從而影響極限的穩(wěn)定性、干擾對所分析物質(zhì)的檢測。
HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過0.45μm濾膜過濾過的。建議每天更換新鮮的水。長期不用時,必須把使用水的管路用有機(jī)溶劑置換,防止長霉。
儀器使用完后要采用適當(dāng)?shù)娜軇_洗等方法維護(hù)色譜柱和系統(tǒng)。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。
儀器長期不用時,不建議使用純乙腈封存。因為乙腈有生成聚合物的趨勢。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。
當(dāng)有流路堵塞時,可以嘗試將之反接后沖洗。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會縮短溶劑過濾器的使用壽命,并且影響泵和系統(tǒng)的的性能。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH 4 至7) 中尤其如此。
4.1.1 過濾器
•檢查溶劑過濾器
查看過濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)–擰開脫氣機(jī)出口或比例閥入口管線,此時溶劑會因為重力流出。當(dāng)脫氣機(jī)或溶劑過濾頭堵塞時,溶劑會流出不暢或不流出–臨時取下過濾器,檢查柱前壓力是否正常。
•清潔溶劑過濾器
將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下,用水沖洗殘留之溶劑,然后將過濾器放在裝有濃硝酸(35%左右)的燒杯里浸一小時。用二次蒸餾水*沖洗過濾器至水為中性可以把過濾器放在塑料燒杯內(nèi)超聲清洗。但是不可使用玻璃器皿將過濾器重新裝好。
•建議:定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶(可以高溫滅菌),每三個月至少清洗一次。
4.1.2 泵的使用要點
?將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面或較高處。當(dāng)在四元泵上使用鹽溶液或有機(jī)溶劑時,建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上,將有機(jī)溶劑接在上面的梯度閥口上,有機(jī)溶劑通道在水或鹽溶液通道的正上面。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出的鹽結(jié)晶。
?操作泵之前,用至少兩個體積(標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)30mL,對微脫氣機(jī)10mL)沖洗真空脫氣機(jī),特別是當(dāng)泵關(guān)閉了一段時間后(例如,過夜),以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時,防止溶劑瓶內(nèi)的玻璃濾頭(過濾器)堵塞及長菌,當(dāng)濾頭表面有黑色或黃色污染層說明發(fā)生了堵塞,應(yīng)立即清洗或更換。
?定期檢查排液閥的過濾白頭。檢查方法:擰開排液閥,以水作流動相。
對于標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)(G1322A),流速5ml/min水,若壓力大于10bar,則建議更換。
對于微量脫氣機(jī)(G1379A),流速2ml/min水,若壓力大于5bar,則建議更換。
?當(dāng)使用低流速時,檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏(用壓力測試或漏液測試。每當(dāng)更換泵密封墊時排液閥慮芯也應(yīng)更換。
?更換活塞密封墊時檢查活塞桿上是否有劃痕。有劃痕的活塞將導(dǎo)致輕度滲漏,并降低密封墊的使用壽命。應(yīng)盡早更換有劃痕的活塞。
?使用緩沖溶液時,關(guān)泵前先用水沖洗系統(tǒng)。當(dāng)需要長時間使 用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時,選用密封墊清洗附件,以減少對密封墊及活塞桿的磨損。
?如果使用了高濃度的緩沖鹽,可以考慮用熱水(50-60℃)來沖洗鹽通道來確保沒有緩沖鹽殘留在系統(tǒng)中。
?更換活塞密封墊后應(yīng)按照密封墊安裝步驟對其進(jìn)行磨合,但磨合不適用于正相密封墊。
?當(dāng)泵頭安裝有柱塞清洗附件時,由于該附件中也有密封墊,這樣就會增加活塞桿運動時的阻力。所以開泵前一定要用10%異丙醇,并將其流速調(diào)至約2-3滴/分鐘使溶液流過沖洗裝置。(對于二元泵SL,如果不使用鹽溶液可以不開)10%異丙醇有助于降低水的表面張力,并有抑菌作用。不要用其它溶劑代替。
?當(dāng)泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10%異丙醇,會使密封墊及活塞桿的壽命減短(二元泵SL除外),泵頭如果發(fā)出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度如果有必要,可以改變壓縮因子(compressibility)來達(dá)到更好的效果。
4.1.3 自動進(jìn)樣器
樣品在進(jìn)樣前必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)先處理,需要經(jīng)過亞微米濾膜的過濾或者離心,防止樣品中的微小顆粒堵塞管路,使用流動相作為溶劑配制樣品,所用溶劑應(yīng)該對樣品有較好的溶解性。
針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的,有時空氣中的較大灰塵顆粒可能恰好落在針座的流路內(nèi)而引起針座的堵塞。這時候可以嘗試卸下針座,將它接在泵的出口上反沖,一般能解決問題。
如果經(jīng)常使用緩沖溶液,除了泵頭之外,ALS計量泵的柱塞及密封圈,六通閥的轉(zhuǎn)子密封圈和定子密封圈應(yīng)該定期清洗,防止有鹽的顆粒磨損ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋;使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會引起ALS故障率的增加及性能的降低。
4.1.4 DAD常見故障及原因
4.2 HPLC日常維護(hù)
4.3 HPLC常見故障診斷
5 HPLC的應(yīng)用
在環(huán)保方面,HPLC可以應(yīng)用在:
(1)農(nóng)藥殘留量分析 :含氯農(nóng)藥 、有機(jī)磷 農(nóng)藥 、除蟲菊等;
(2)致癌物質(zhì):硝基呋喃及其代謝物、霉素、亞硝胺、苯并芘等;
(3)水質(zhì)分析:內(nèi)分泌污染物等;
(4)其它……
在生化方面,HPLC可以應(yīng)用于:
(1)蛋白質(zhì)分析;
(2)肽類的分析;
(3)核酸;
(4)氨基酸 ;
(5)其它……