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玉米、大米、小麥和玉米油中的玉米赤霉烯酮的測(cè)定
閱讀：606發(fā)布時(shí)間：2021-10-15
介紹
01
為加快糧食產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，推進(jìn)糧食產(chǎn)業(yè)供給和結(jié)構(gòu)性質(zhì)改革，國(guó)家糧食局推出“優(yōu)質(zhì)糧食工程"，并開(kāi)展“中國(guó)好糧食"行動(dòng)。睿科集團(tuán)積極響應(yīng)政策的同時(shí)，憑借豐富的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)相關(guān)政策標(biāo)準(zhǔn)制定了系列解決方案，并將各種自動(dòng)化設(shè)備應(yīng)用于前處理過(guò)程，盡可能地幫助實(shí)驗(yàn)員提高工作效率，保證糧油產(chǎn)品檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
值此世界糧食日（2021年10月16日）來(lái)臨之際，我們分享用Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀分析糧油中玉米赤霉烯酮的解決方案。試樣經(jīng)過(guò)90%乙腈水溶液提取，提取液經(jīng)離心、稀釋后用含有玉米赤霉烯酮特異抗體的免疫親和柱自動(dòng)凈化。用5 mL水淋洗柱子將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，以甲醇洗脫免疫親和柱。將洗脫液在55°C條件下氮吹干，用1 mL初始流動(dòng)相定容，經(jīng)高效液相色譜儀上機(jī)分析。
圖-1玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)式
本應(yīng)用文章參考GB5009.209-2016《食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定》第一法，采用免疫親和柱凈化，高效液相色譜檢測(cè)，建立了復(fù)雜糧油樣品基質(zhì)中玉米赤霉烯酮高靈敏度的前處理和分析方法，得到四種常見(jiàn)糧油基質(zhì)中玉米赤霉烯酮的加標(biāo)回收率在88.0%-112.0%之間，RSD值小于5%。
儀器與耗材
02
Auto Prep 200全自動(dòng)液體樣品處理工作站；Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀 ；
Auto EVA 80 全自動(dòng)平行濃縮儀；
玉米赤霉烯酮免疫親和柱 (Romer，1500ng/3mL)；
高效液相色譜: Waters ACQUITY UPLC I-Class配備大體積流通池；
甲醇（Merck，色譜純）；乙腈（Merck，色譜純）；吐溫-20（Sigma，試劑純）；超純水（Waston）；
PBS鹽包
配標(biāo)
凈化
濃縮
標(biāo)準(zhǔn)曲線配制
03
使用Auto Prep 200全自動(dòng)液體樣品處理工作站可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的全自動(dòng)化配制，將單標(biāo)母液(1000 mg/L)通過(guò)工作站的直接稀釋模式，配制成濃度為10 mg/L的工作中間液，緊接著可通過(guò)程序設(shè)置，吸取該工作液，配制一條濃度分別為0.01 mg/L，0.02 mg/L，0.1 mg/L，0.2 mg/L和0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
圖-2. Auto Prep 200 液體工作站配標(biāo)程序
樣品提取與前處理
04
大米、玉米、小麥樣品
準(zhǔn)確稱取5 g粉碎過(guò)的樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水溶液(9:1)(v/v)，渦旋震蕩提取20 min，以7000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min；取5 mL上清液于試管中，加入20 mL 0.1%吐溫-20的PBS緩沖液混勻，以7000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取10 mL上清液于80 mL上樣管中，待用。
玉米油樣品
準(zhǔn)確稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水溶液(9:1)(v/v)，渦旋震蕩提取20 min，以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min；余下步驟同上。
固相萃取凈化條件
全自動(dòng)固相萃取儀 | Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀 |
固相萃取柱 | 玉米赤霉烯酮免疫親柱 (1500ng/3mL) |
淋洗 | 超純水 |
洗脫 | 甲醇 |
表-1 固相萃取凈化條件
以2 mL/min的速度精確上樣10 mL待測(cè)液，5 mL水清洗樣品瓶，5 mL水淋洗免疫親和柱，氣推30 mL吹干免疫親和柱，推速為80 mL/min。最后用2 mL甲醇以0.5mL/min的速度洗脫樣品，收集洗脫液用Auto EVA 80 全自動(dòng)平行濃縮儀于55°C、1 L/min條件下吹干，用初始流動(dòng)相定容至1 mL，過(guò)濾膜上機(jī)分析。詳細(xì)步驟見(jiàn)圖-3。
圖-3. Fotector Plus 玉米赤霉烯酮免疫親和柱凈化方法
檢測(cè)條件
05
色譜柱 | Waters BEH-C18(2.1×100 mm,1.7 um) |
流速 | 0.200 mL/min |
流動(dòng)相 | 水:甲醇:乙腈=46:8:46 |
柱溫 | 35°C |
進(jìn)樣體積 | 10 μL |
梯度洗脫 | 等度洗脫 |
熒光檢測(cè)器 | 激發(fā)波長(zhǎng)303nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm |
表-2 玉米赤霉烯酮液相色譜檢測(cè)條件
樣品測(cè)試
06
分別取大米、玉米、小麥樣品各5g，添加20 ug/kg的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行上述步驟的前處理凈化。
取空白玉米油樣品5 g，添加20 ug/kg的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行上述步驟的前處理凈化。
樣品回收率如下表-3所示：
表-3添加水平為20 ug/kg樣品回收率結(jié)果
結(jié)果與討論
07
1.樣品提取液pH對(duì)回收率的影響
只用純水稀釋樣品提取液進(jìn)行上述凈化步驟，樣品中的加標(biāo)回收率只有71-78%；若采用0.1%吐溫-20的PBS緩沖液進(jìn)行樣品提取液稀釋?zhuān)瑯悠坊厥章蕿?8-112%。
2.洗脫速度的影響
采用1 mL/min的洗脫速度，洗脫效果不佳，回收率在72%-81%；降低洗脫速度至0.5 mL/min，洗脫效果有明顯提升，回收率在88-112%。因此洗脫速度不宜設(shè)置得過(guò)快。
3.乙腈提取液用PBS緩沖液稀釋后容易變渾濁，用濾紙過(guò)濾混合液效果不佳，因此建議采用高速離心的方式使混合液變澄清以利于后續(xù)的過(guò)柱。
4.谷物中離心完成后，不可放置過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，否則谷物容易重新吸水，可能導(dǎo)致提取液的濃度過(guò)高，使樣品的回收率偏高，影響測(cè)試結(jié)果。
5.固相萃取進(jìn)行提取液凈化前，特別對(duì)于偏酸或偏堿性樣品，應(yīng)用PBS緩沖溶液（pH=7.4）進(jìn)行稀釋后上機(jī)，否則可能會(huì)導(dǎo)致回收率偏低。
總結(jié)
1. 采用高通量全自動(dòng)固相萃取儀法，準(zhǔn)確性、重復(fù)性、再現(xiàn)性均滿足符合GB 5009.209-2016 要求。
2. 采用Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)能同步進(jìn)行6個(gè)樣品凈化，連續(xù)自動(dòng)處理60個(gè)樣品，做樣通量高；同時(shí)可無(wú)人值守，提高了工作效率。此外還可避免工作人員因操作失誤導(dǎo)致的檢測(cè)偏差。
3. ?？?Auto Prep 200全自動(dòng)液體工作站可實(shí)現(xiàn)混標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的自動(dòng)配制，全程無(wú)需人為值守，讓實(shí)驗(yàn)人員遠(yuǎn)離有毒有害的化學(xué)物質(zhì)。
4. ?？艫uto EVA 80 全自動(dòng)平行濃縮儀處理通量高，80個(gè)樣品可同時(shí)進(jìn)行氮吹，實(shí)驗(yàn)平行性好；采用氮吹針自動(dòng)追隨液面的設(shè)計(jì)，無(wú)需手動(dòng)調(diào)節(jié)氮吹針且耗氣量小，省時(shí)省力。
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