AlphaFold 3在預(yù)測生物分子的結(jié)構(gòu)和相互作用方面取得了突破性進(jìn)展，其預(yù)測精度相比現(xiàn)有方法至少提高了50%【1】。這項(xiàng)技術(shù)不僅能夠模擬蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，還能模擬DNA、RNA以及藥物配體等大型生物分子，并預(yù)測其在空間中的相互作用關(guān)系，為藥物發(fā)現(xiàn)和疾病治療提供了新的視角。
AlphaFold 3的問世引起醫(yī)藥研發(fā)、疾病治療領(lǐng)域的轟動(dòng)，特別是在抗體藥物的研發(fā)中，需要精確了解抗體與其目標(biāo)分子之間的相互作用，這是決定藥物療效的關(guān)鍵。AI技術(shù)為我們發(fā)現(xiàn)抗原抗體相互作用帶來了巨大提速，但抗體藥研發(fā)是一項(xiàng)復(fù)雜的科學(xué)工程，我們依然面臨許多挑戰(zhàn)。
治療性抗體藥競爭激烈，企業(yè)研發(fā)如何脫穎而出
2023年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了12種新的抗體藥物上市，其中包括8種單克隆抗體和4種雙特異性抗體。
在這批新批準(zhǔn)的單抗藥物中，值得一提的是渤健制藥開發(fā)的侖卡奈單抗（Lecanemab）【2】。這款藥物針對β-淀粉樣蛋白，是阿爾茨海默病治療領(lǐng)域的重要突破。據(jù)預(yù)測，侖卡奈單抗的市場銷售額將達(dá)到18.67億美元，將成為該領(lǐng)域重磅新藥【3】。
在雙特異性抗體藥物方面，2023年在血液腫瘤領(lǐng)域有多款新藥獲批上市。例如，Elrexfio和Talvey是用于治療多發(fā)性骨髓瘤的新藥，分別針對BCMA/CD3和GPRC5D/CD3靶點(diǎn)。此外，Epkinly和Columvi是用于治療大B細(xì)胞淋巴瘤的新藥，均靶向CD20和CD3【4】。
不同類型的抗體類新藥開發(fā)進(jìn)展及疾病領(lǐng)域
從近年來開展臨床試驗(yàn)的抗體類型來看，單特異性抗體仍是抗體藥物研發(fā)的焦點(diǎn)，其臨床研究熱度在近三年內(nèi)并無顯著變化。雙特異性、多特異性抗體和抗體偶聯(lián)藥物領(lǐng)域的研究熱度呈現(xiàn)上升趨勢，但多特異性抗體仍占據(jù)較小比例【3】。
從靶點(diǎn)選擇上來看，目前已上市的抗體藥物主要是針對PD-1/L1、HER2、CD20、TNF-α、IL-6等熱門靶點(diǎn)。其中，PD-1/L1是近年來熱門的靶點(diǎn)之一，呈現(xiàn)出激烈競爭的態(tài)勢。
Nature Reviews Drug Discovery 20, 10 (2021)
先進(jìn)生物分析技術(shù)，突破抗體藥研發(fā)難點(diǎn)
盡管抗體藥物的發(fā)展前景廣闊，但在研發(fā)過程中仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。
1 新靶點(diǎn)難以開發(fā)
抗體藥物的開發(fā)過程中，首要挑戰(zhàn)之一就是新靶點(diǎn)的開發(fā)。盡管已經(jīng)有許多已知的藥物靶點(diǎn)，但是在某些疾病，特別是一些罕見疾病和復(fù)雜的多因素性疾病中，仍然缺乏有效的靶點(diǎn)。此外，對于已知的靶點(diǎn)，也需要進(jìn)一步研究其在疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用，以便開發(fā)出更有效的抗體藥物【5】。
在這一過程中，先進(jìn)的生物分析技術(shù)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。2023年Cancer Research發(fā)表了一篇關(guān)于針對EGFR/HER3靶點(diǎn)的創(chuàng)新雙特異性抗體藥物偶聯(lián)物BL-B01D1的文章，研究表明BL-B01D1在多種癌癥（如非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) ）的I期臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出優(yōu)異的療效【6】。
BL-B01D1來源于SI-B001（也稱為SI-1X6.4）四價(jià)雙特異性抗體，CN116490523A描述了采用Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)高通量地分析與準(zhǔn)確地表征SI-1X6.4的結(jié)合活性。在親和力檢測的基礎(chǔ)上，Octet® 還驗(yàn)證了SI-1X6.4具備同時(shí)結(jié)合HER3與EGFR靶點(diǎn)的特性，從而實(shí)現(xiàn)雙特異性抗體1+1＞2的協(xié)同作用。
Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)能夠測量抗體與其靶標(biāo)之間的相互作用，包括結(jié)合親和力、動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及濃度依賴性分析。這些信息對于理解抗體與新靶點(diǎn)的相互作用至關(guān)重要，有助于篩選和優(yōu)化潛在的抗體藥物候選物。
2 篩選效率低下
抗體藥物研發(fā)通常需要大規(guī)模篩選，以確定具有活性和選擇性的候選藥物。然而，傳統(tǒng)篩選方法效率低，耗時(shí)耗力。隨著技術(shù)的發(fā)展，一些新的高通量篩選技術(shù)已經(jīng)開始應(yīng)用于抗體的篩選過程。
ImmunoPrecise Antibodies公司采用iQue® 高通量流式細(xì)胞儀和ForeCyt® 軟件，優(yōu)化了單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)流程，顯著提高了單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的效率。這項(xiàng)高通量技術(shù)能夠快速檢測大量細(xì)胞克隆的抗原表達(dá)，在5分鐘內(nèi)完成96孔板的檢測，極大縮短了篩選時(shí)間。在血清評估階段，將近2,500份血清樣品通過獨(dú)特的編碼技術(shù)進(jìn)行了抗體結(jié)合評估，確保了抗體的特異性。在雜交瘤篩選過程中，通過多重細(xì)胞結(jié)合分析，9,600個(gè)雜交瘤克隆的上清液在一天內(nèi)完成了抗體結(jié)合和特異性的測定。
這些技術(shù)的應(yīng)用不僅加快了抗體Leads的產(chǎn)生，還通過“微型化”分析模式降低了成本，節(jié)省了寶貴的抗體上清液，為后續(xù)的驗(yàn)證性或功能性研究提供了資源。
iQue® 高通量流式細(xì)胞儀加速靶點(diǎn)篩選流程：
快速分析多參數(shù)：iQue® 可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析多個(gè)標(biāo)記物，這有助于識(shí)別和確認(rèn)疾病相關(guān)的特定細(xì)胞表面標(biāo)記物。這種多參數(shù)分析能夠處理大量樣本，提供關(guān)于不同細(xì)胞群體的詳細(xì)信息。
高通量篩選：iQue® 能夠快速篩選大量的細(xì)胞樣本和抗體，這有助于快速鎖定具有治療潛力的抗體候選物。處理 96 孔板僅需 5 分鐘，或在 20 分鐘內(nèi)處理384 孔板。
微量化：獨(dú)特的采樣技術(shù)，可以從微量樣本中采樣，最少只需一微升, 節(jié)約珍貴的樣本和試劑。
3 開發(fā)中的工藝優(yōu)化
在抗體開發(fā)過程中，抗體表達(dá)需要進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液收獲的實(shí)驗(yàn)。處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液極為困難，經(jīng)常需要快速完成任務(wù)，同時(shí)盡可能減少細(xì)胞培養(yǎng)液的損失。
在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的澄清過程中，廣泛采用的方法是先進(jìn)行離心，然后用0.2, 0.22或0.45 μm 過濾器過濾清除的上清液。傳統(tǒng)的離心和過濾過程存在速度慢、易堵塞、處理量低、質(zhì)量差（如內(nèi)毒素污染）等的局限性。
Sartoclear Dynamics® Lab套裝專為實(shí)驗(yàn)室而設(shè)計(jì)，可快速收獲15 mL至1,000 mL體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，免去澄清所需的離心步驟，一步完成澄清和除菌過濾。幾分鐘內(nèi)就能輕松快速地澄清和除菌多達(dá)1,000 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液。
尋找下一代抗體發(fā)現(xiàn)的新方向
面對現(xiàn)有挑戰(zhàn)，科研界正在積極探索新的技術(shù)路徑。其中，高通量單B細(xì)胞克隆技術(shù)和人工智能（AI）輔助的抗體設(shè)計(jì)成為了研發(fā)新一代抗體藥物的兩大前沿方向。
1 高通量單B細(xì)胞克隆技術(shù)
在抗體發(fā)現(xiàn)中，使用免疫動(dòng)物并將其免疫B細(xì)胞永生化為雜交瘤是傳統(tǒng)的方法之一，但這種方法存在一些勞動(dòng)密集、耗時(shí)和吞吐量有限的缺點(diǎn)。因此，直接挖掘原代B細(xì)胞抗體庫的技術(shù)對于抗體發(fā)現(xiàn)越來越重要，高通量單B細(xì)胞克隆技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。
高通量單B細(xì)胞克隆技術(shù)通過從免疫動(dòng)物中提取B細(xì)胞，并利用高通量篩選技術(shù)快速、準(zhǔn)確地分析大量單個(gè)B細(xì)胞的抗體基因序列，有助于我們挖掘更多潛在的抗體候選物。
最近的一篇來自于牛津大學(xué)的文章中【7】，作者使用CellCelector全自動(dòng)無損細(xì)胞分離系統(tǒng)作為分離原代B細(xì)胞以發(fā)現(xiàn)抗體的平臺(tái)。該研究篩選了CD138+ B細(xì)胞的子集，在1189個(gè)抗體分泌細(xì)胞 (ASC) 中鑒定出238個(gè)潛在的EGFR特異性B細(xì)胞，并通過CellCellector成功篩選并分離出94個(gè)高產(chǎn)量陽性克隆。鑒定了一組不同的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)序列，并將其中20個(gè)克隆表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)人免疫球蛋白G1抗體形式。進(jìn)一步表征并鑒定了13種結(jié)合可溶性和天然形式EGFR的重組抗體。
通過將該方法擴(kuò)展至從一種EGFR免疫的XenoMouse®（首批完全人類轉(zhuǎn)基因抗體生成動(dòng)物之一）中提取的所有400,000個(gè)CD138+ B細(xì)胞，研究人員發(fā)現(xiàn)了潛在的1196種獨(dú)特的EGFR特異性抗體。CellCelector平臺(tái)的優(yōu)勢在于能夠分離特定感興趣的治療靶點(diǎn)的B細(xì)胞。此外，從分離的B細(xì)胞中回收的抗體序列成功結(jié)合可溶性和天然形式的EGFR，進(jìn)一步驗(yàn)證了CellCellector作為一種有效的抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的潛力。
代表性熒光和明場圖像，展示了從納米孔中挑選一個(gè)EGFR+ ASC并將其轉(zhuǎn)移到含有裂解緩沖液的96孔PCR板的B1孔中進(jìn)行分子回收。圖像居中并自動(dòng)分配綠色輪廓到要挑選的孔和B細(xì)胞。
（A）647 nm特異性熒光發(fā)射（紅色）的圖像，可以觀察到兩個(gè)相鄰的孔包含ASC。（B）488 nm特異性熒光發(fā)射（綠色）的圖像，可以觀察到一個(gè)相鄰的孔包含特異于EGFR的ASC。（C）647 nm和488 nm通道圖像的疊加圖像，以及（D）用于挑選EGFR+ ASC的明場圖像。明場圖像（E）在從納米孔中挑選EGFR+ ASC之前，以及（F）在挑選之后。明場圖像顯示納米孔內(nèi)的所有內(nèi)容物都被挑選出來。
由此可見，賽多利斯的CellCelector系統(tǒng)結(jié)合了獨(dú)特的納米孔技術(shù)和高通量細(xì)胞篩選、成像、靈敏的單細(xì)胞測定以及精準(zhǔn)細(xì)胞分離功能，使得在同一天內(nèi)處理數(shù)千個(gè)血漿單B細(xì)胞成為可能。通過單細(xì)胞分析，CellCelector能夠檢測到傳統(tǒng)篩選方法難以發(fā)現(xiàn)的稀有抗體特性。該系統(tǒng)的熒光篩選功能具有高靈敏度和多通道檢測能力，能夠?qū)崟r(shí)獲取并分析熒光圖像，精確識(shí)別目標(biāo)B細(xì)胞。CellCelector還支持立即對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多種測試分析，避免了傳統(tǒng)方法中需要培養(yǎng)數(shù)周以獲得足夠細(xì)胞數(shù)量的步驟。這些特點(diǎn)使得CellCelector在B細(xì)胞篩選中表現(xiàn)出色，廣泛應(yīng)用于抗體發(fā)現(xiàn)、免疫監(jiān)測和單細(xì)胞研究等領(lǐng)域。
全自動(dòng)無損細(xì)胞分離系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化單B細(xì)胞及分泌物篩選和分離
CellCeIector與獨(dú)特的納米孔技術(shù)相結(jié)合，并將高通量細(xì)胞掃描成像、分析篩選、單細(xì)胞和克隆自動(dòng)化分離結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了同一天共同處理數(shù)萬個(gè)血漿單B細(xì)胞的操作
CellCeIector基于精準(zhǔn)且溫和的機(jī)械挑取模式，確保細(xì)胞的高存活率
2 人工智能（AI）輔助的抗體設(shè)計(jì)
人工智能在抗體設(shè)計(jì)領(lǐng)域的應(yīng)用展現(xiàn)出了巨大的潛力。AI技術(shù)可以幫助我們預(yù)測和模擬抗體與抗原的相互作用，從而加速抗體設(shè)計(jì)的過程。通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法和大數(shù)據(jù)分析，AI可以幫助我們優(yōu)化抗體的親和性、特異性和穩(wěn)定性，進(jìn)而設(shè)計(jì)出更加高效和理想的抗體藥物。
艾諾森、義翹神州和南方研究院的合作研究表明，AI設(shè)計(jì)的抗體能夠針對多種SARS-CoV-2毒株提供廣泛中和能力【8】。在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)通過整合多種數(shù)據(jù)類型和處理策略，如機(jī)器學(xué)習(xí)、自然語言處理、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模和蛋白質(zhì)序列語言建模，成功生成了SARS-CoV-2的數(shù)字孿生，并計(jì)算設(shè)計(jì)針對1300多種不同SARS-CoV-2歷史毒株的廣泛中和抗體。這些毒株在受體結(jié)合域（RBD）區(qū)域包含64個(gè)突變。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，AI設(shè)計(jì)的抗體在針對多種毒株的真實(shí)病毒中和測定中表現(xiàn)出良好效果，包括最新的Omicron毒株。許多抗體在ELISA測定中展現(xiàn)出對多種毒株RBD的強(qiáng)大結(jié)合能力。
基于人工智能的 SARS-COV-2 廣泛中和抗體設(shè)計(jì)
這些結(jié)果為塑造未來病毒株的治療設(shè)計(jì)提供了重要參考，并有助于預(yù)測病毒進(jìn)化中的潛在模式。人工智能可以通過學(xué)習(xí)這些模式來開發(fā)未來的抗病毒治療方法。
未來展望
隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，治療性抗體的研發(fā)正處于快速發(fā)展之中。面對行業(yè)發(fā)展的各種挑戰(zhàn)和痛點(diǎn)，采用先進(jìn)的技術(shù)和綜合性解決方案是提高研發(fā)效率、降低成本、保證藥物質(zhì)量和安全的關(guān)鍵。
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【8】Kang, Y., Jiao, Y., Jin, K., & Pan, L. (2023). AI-Designed, Mutation-Resistant Broad Neutralizing Antibodies Against Multiple SARS-CoV-2 Strains. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2023.03.25.534209
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