利用噬菌體病毒選擇性感染和殺死致病菌，稱(chēng)為噬菌體療法。目前，噬菌體篩選的主要手段包括基于光學(xué)的測(cè)定，不能在復(fù)雜的介質(zhì)中進(jìn)行，如有色溶液、不均勻混合物或高粘度樣品。
為應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，研究人員采用基于生物層干涉技術(shù)（Biolayer interferometry，BLI）的Octet®非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng)，建立了噬菌體層干涉術(shù)（Phage-layer interferometry，PLI）作為噬菌體伴隨診斷方法[1]。
PLI不僅為一種定量的噬菌體篩選方法，同時(shí)可以作為細(xì)菌檢測(cè)平臺(tái)。PLI易于自動(dòng)化，還可以在復(fù)雜、不透明的介質(zhì)中發(fā)揮作用，如嬰兒配方奶粉。PLI方法的建立，將對(duì)預(yù)防食源性疾病及對(duì)抗AMR（抗生素耐藥性）產(chǎn)生直接而廣泛的影響。那么，PLI技術(shù)又是如何誕生的呢？接下來(lái)讓我們一睹為快！
圖1. PLI實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌結(jié)合和裂解：
第1步，baseline,緩沖液平衡；
第2步，噬菌體固化在Octet®傳感器上；
第3步，細(xì)菌結(jié)合；
第4步，緩沖液中解離
PLI方法開(kāi)發(fā)
鑒于噬菌體T7展現(xiàn)出極高的治療潛力，研究者因此選擇其來(lái)合成噬菌體功能化的BLI傳感器，用作PLI噬菌體生物傳感器的原型。首先，將純化的T7進(jìn)行生物素化，并通過(guò)透析法去除多余生物素，然后T7-bio就可以固化在SA傳感器上。
上圖：噬菌體生物素化示意圖；左圖：T7噬菌體固化的信號(hào)較高，說(shuō)明其可以成功固化在SA傳感器上
圖2. T7噬菌體生物素化和傳感器固化示意圖
研究人員通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)一步確認(rèn)了傳感器表面的T7的功能化不受影響。固化后的噬菌體平均長(zhǎng)度和直徑分別為85±15nm和66±11nm，與之前研究報(bào)道的3D 冷凍電子斷層掃描衍生模型計(jì)算出的尺寸非常吻合。由于Octet®傳感器是由玻璃光纖制成，可以在SEM下直接觀察。
圖3. 固定化T7顆粒的代表性SEM圖像與冷凍電子斷層掃描3D模型的比較
PLI方法評(píng)估
噬菌體宿主范圍篩選：將T7傳感器浸沒(méi)在細(xì)菌肉湯培養(yǎng)物中并通過(guò)PLI信號(hào)隨時(shí)間的變化來(lái)研究噬菌體-宿主動(dòng)力學(xué)。通過(guò)BW25113（敏感菌株）和BW25113 ΔwaaCΔtrxA（耐藥菌株）進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)BW25113與T7傳感器的結(jié)合信號(hào)更強(qiáng)，并進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)確認(rèn)了PLI良好的重復(fù)性。這一發(fā)現(xiàn)證明PLI在研究噬菌體宿主范圍時(shí)可通過(guò)比較噬菌體結(jié)合能力參數(shù)進(jìn)行篩選。
圖4.細(xì)菌結(jié)合的PLI信號(hào)：BW25113（敏感菌株）PLI信號(hào)比BW25113 ΔwaaCΔtrxA（耐藥菌株）高
量化噬菌體感染參數(shù)（如宿主結(jié)合和潛伏期）：細(xì)菌結(jié)合后將傳感器洗滌并在LB中孵育測(cè)量裂解動(dòng)力學(xué)。由于細(xì)菌解離，BW25113和BW25113ΔwaaCΔtrxA前期檢測(cè)信號(hào)略有下降。120分鐘后，BW25113信號(hào)急劇增加后迅速降低，表明噬菌體感染引起細(xì)菌腫脹后裂解（劃重點(diǎn)！在解離觀察到信號(hào)起伏就說(shuō)明細(xì)菌被噬菌體裂解了?。６鳥(niǎo)W25113ΔwaaCΔtrxA沒(méi)有產(chǎn)生“裂解”信號(hào)?？紤]到PLI是實(shí)時(shí)的檢測(cè)，所以在PLI中可觀察到單個(gè)感染周期，因此可以推斷噬菌體潛伏期，T7在室溫下的潛伏時(shí)間為193 ± 26分鐘。通過(guò)PLI測(cè)定潛伏期與傳統(tǒng)方法相比操作更為簡(jiǎn)單。
圖5.在解離步驟中，PLI發(fā)現(xiàn)BW25113細(xì)菌裂解
研究人員還通過(guò)SEM確認(rèn)了傳感器的細(xì)菌裂解碎片上覆蓋著T7（白色顆粒），從而證實(shí)噬菌體傳感器誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解。
圖6. 傳感器表面上細(xì)菌裂解和裂解產(chǎn)物的代表性圖像：C圖為菌體開(kāi)始裂解，但是菌體相對(duì)完整；D，E圖為裂解后的細(xì)菌，并附著噬菌體
PLI實(shí)戰(zhàn)1—能被噬菌體裂解的細(xì)菌篩選
研究人員使用ECOR集合（該集合包括來(lái)自世界各地的大腸桿菌菌株）中的30種細(xì)菌篩選T7宿主范圍，并與傳統(tǒng)的噬菌體篩選方法DLA(雙瓊脂覆蓋試驗(yàn))進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示PLI比傳統(tǒng)方法具有更高靈敏度，如ECOR-16在DLA測(cè)定中未被確定為敏感，但在PLI檢測(cè)中觀察到裂解信號(hào)后，重新分析DLA培養(yǎng)皿，可在最濃縮的稀釋度下顯示出小斑塊?？梢?jiàn)，PLI測(cè)量噬菌體宿主范圍的能力更強(qiáng)，并易于比較噬菌體感染參數(shù)如宿主結(jié)合動(dòng)力學(xué)和潛伏期，從而實(shí)現(xiàn)更標(biāo)準(zhǔn)化的噬菌體候選物篩選過(guò)程。
圖7. PLI檢測(cè)ECOR集合中 30 種菌株的結(jié)合和裂解
PLI實(shí)戰(zhàn)2—奶粉中診斷細(xì)菌
由于噬菌體通過(guò)結(jié)合細(xì)菌來(lái)診斷細(xì)菌的存在，而Octet®具有在復(fù)雜樣品中檢測(cè)的能力，因此研究人員將PLI用于檢測(cè)嬰兒配方奶粉的細(xì)菌污染。嬰兒配方奶粉是不透明的，很難通過(guò)傳統(tǒng)的光譜方法進(jìn)行分析。將T7生物傳感器浸入嬰兒配方奶粉中檢測(cè)，與未污染的奶粉相比受污染的奶粉的結(jié)合信號(hào)更高。在LB培養(yǎng)基中解離，觀察到受污染的奶粉檢測(cè)信號(hào)存在裂解特征，未污染的奶粉僅顯示非特異性結(jié)合分子從傳感器表面的解離信號(hào)。
圖8. ?PLI檢測(cè)污染的嬰兒配方奶粉：左圖，在奶粉中，噬菌體結(jié)合細(xì)菌PLI信號(hào)；右圖，在LB培養(yǎng)基中解離，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的裂解信號(hào)
Octet®還提供其他配套的傳感器固化病毒，比如本文還用AR2G（氨基偶聯(lián)）傳感器結(jié)合帶正電荷的聚乙烯亞胺（PEI）聚合物，再捕獲與噬菌體結(jié)合的細(xì)菌，并進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與生物素化后固化在SA傳感器結(jié)果類(lèi)似。
以上就是BLI變身PLI的全過(guò)程，PLI之所以適合于復(fù)雜樣本檢測(cè)以及長(zhǎng)時(shí)間（400-500mins）細(xì)菌裂解動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)，主要得益于Octet®技術(shù)特點(diǎn)，浸入即讀的模式可以使檢測(cè)樣本不受限制，無(wú)流路的限制可以在長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)時(shí)節(jié)省大量樣本!
除了以上優(yōu)勢(shì)Octet® BLI還具備以下特點(diǎn)：
非標(biāo)記Direct Binding是趨勢(shì)，不需要標(biāo)記和信號(hào)放大，可以更好的保持反應(yīng)物的活性
快速測(cè)定親和力，提供結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)更加定量化地表征分子互作
無(wú)洗滌步驟，可測(cè)弱親和力（解離快）
寫(xiě)入了美國(guó)藥典，文章多，認(rèn)可度廣
萬(wàn)金油技術(shù)，可以用與檢測(cè)小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子，還可以檢測(cè)細(xì)菌，噬菌體等
操作簡(jiǎn)便，耗材及維護(hù)成本低
-參考文獻(xiàn)-
[1] Needham, P., Page, R. C., & Yehl, K. (2024). Phage-layer interferometry: a companion diagnostic for phage therapy and a bacterial testing platform. Scientific reports, 14(1), 6026. https://doi.org/10.1038/s41598-024-55776-1
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