細(xì)胞治療為疾病治愈提供了新的方法，給患者帶來新的希望。然而，由于缺乏高度癌癥特異性的表面標(biāo)記物，細(xì)胞治療在免疫治療靶點(diǎn)的選擇上面臨挑戰(zhàn)，并且在應(yīng)用上有一定的局限性。首先，由于正常細(xì)胞也表達(dá)靶點(diǎn)，使得治療中表現(xiàn)出顯著毒性。其次，大多數(shù)與實(shí)體腫瘤相關(guān)的抗原屬于胞內(nèi)蛋白，很難被識(shí)別，所以對(duì)于大多數(shù)實(shí)體瘤，細(xì)胞治療仍顯得力不從心。
今天，陳老濕為大家推薦幾篇近期發(fā)表的細(xì)胞治療相關(guān)文章，這些研究在一定程度上提出了解決上述問題的方法。當(dāng)然，這些文章均在研究過程中使用了賽多利斯的Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)和Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)，讓我們一起來看看吧。
Octet®
Incucyte®
Nature Cancer
嶄新的方法發(fā)現(xiàn)更特異的腫瘤標(biāo)志物！[1]
研究人員在美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校開發(fā)了一種新方法，他們首先使用化學(xué)交聯(lián)劑將細(xì)胞表面的蛋白連接在一起，這一步驟可以在原位“凍結(jié)”蛋白質(zhì)的自然構(gòu)象，并保留其相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息。然后，他們對(duì)這些蛋白進(jìn)行糖蛋白氧化和生物素化處理，由于生物素與鏈霉親和素有很強(qiáng)的結(jié)合能力，利用這種蛋白富集方法，研究人員成功地增加了對(duì)腫瘤相關(guān)肽的質(zhì)譜覆蓋。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，整合素β2的活化構(gòu)象是急性白血病的一個(gè)標(biāo)志物（圖1）。
圖1. 活性腫瘤表面抗原構(gòu)象篩選策略
研究人員利用基于完全人類框架序列的抗原結(jié)合片段（Fab）噬菌體展示平臺(tái)，對(duì)重組整合素β2抗體進(jìn)行篩選（圖2）。他們從約1010個(gè)候選結(jié)合物庫中，確定了10個(gè)與整合素β2有結(jié)合作用的候選物（Hit），其中5個(gè)通過基于生物層干涉技術(shù)（BLI）的Octet® 進(jìn)行驗(yàn)證，確定能與活性整合素β2結(jié)合，其中編號(hào)7065#Hit最強(qiáng)。
圖2.展示篩選與活性整合素β結(jié)合的Fab片段：左圖為嵌合抗原受體（CAR）篩選過程；右圖為Octet® 檢測(cè)的親和力結(jié)果
基于7065#抗體，研究人員篩選設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞，并使用Incucyte® 評(píng)估了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性和T細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，針對(duì)活性整合素β2（aITGB2）的CAR-T細(xì)胞在殺傷活性上優(yōu)于傳統(tǒng)的針對(duì)CD33的CAR-T細(xì)胞，同時(shí)也保持了T細(xì)胞的增殖活性。
圖3. Nomo1細(xì)胞被標(biāo)記mCherry，而CAR-T細(xì)胞則被標(biāo)記GFP，y軸代表通過熒光強(qiáng)度檢測(cè)細(xì)胞增殖的情況（mCherry上圖，GFP下圖）；在1:1的效應(yīng)-腫瘤（E:T）比例下，aITGB2 CAR-T細(xì)胞毒性水平與cd33 CAR-T細(xì)胞相似（左上）；在1:10的E:T比例下，aITGB2 CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)優(yōu)于抗cd33（右上）；兩種CAR-T細(xì)胞在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出相似的增殖（下面兩幅圖）；使用Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)，每4個(gè)小時(shí)自動(dòng)拍攝一次，并計(jì)算mCherry和GFP熒光
本文驗(yàn)證了一種潛在的系統(tǒng)性方法來識(shí)別和靶向癌癥中的構(gòu)象特異性抗原，基于活化整合素的CarT療法，值得在AML中進(jìn)行進(jìn)一步的臨床前評(píng)估，并為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向免疫治療靶點(diǎn)的其他應(yīng)用提供了途徑。
Nature
新型針對(duì)實(shí)體瘤的細(xì)胞治療法[2]
實(shí)體腫瘤靶點(diǎn)蛋白的降解片段，可以通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC） 呈遞到腫瘤細(xì)胞表面，并被免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。美國(guó)費(fèi)城兒童醫(yī)院的研究人員非常巧妙地選擇了很難通過蛋白突變找到治療靶點(diǎn)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤作為研究對(duì)象，篩選出了特異存在于腫瘤細(xì)胞表面的多肽。以這些多肽為靶點(diǎn)，他們開發(fā)了一種新型的嵌合抗原受體CAR-T治療，并命名：PC-CAR（“Peptide-centric” Chimeric Antigen Receptors，多肽中心嵌合抗原受體）。將MHC分子結(jié)合的多肽通過類似Pull-down的方法富集，然后用質(zhì)譜的方法進(jìn)行鑒定，然后通過大型基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析對(duì)比和親和力預(yù)測(cè)，研究人員確定了一種未突變的神經(jīng)母細(xì)胞瘤肽，它源自PHOX2B（一種神經(jīng)母細(xì)胞瘤依賴性基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）。以這個(gè)多肽為靶點(diǎn)，使用噬菌體展示的方法篩選出了特異性的ScFv作為CAR，名字為10LH，使用Octet®測(cè)得其與PHOX2B親和力為13nM。
圖4. 左圖為PC-CAR示意圖，當(dāng)中紅色為呈遞的抗原；
右圖使用Octet® 固化10LH，與多肽進(jìn)行結(jié)合解離；kd=76×10−4/s，KD=13 nM，而另外一種ScFv 302LH的解離速率較快，親和力較低
接下來就是以免疫細(xì)胞殺傷為主的功能實(shí)驗(yàn)，而在這篇文章中這個(gè)實(shí)驗(yàn)的主力就是Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)。在殺傷實(shí)驗(yàn)中，加入Caspase 3/7 紅色熒光染料，靶點(diǎn)細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）帶GFP綠色熒光，使用Incucyte® 實(shí)時(shí)計(jì)算紅色熒光面積和綠色熒光面積。紅色熒光面積升高快，綠色熒光下降快，則代表殺傷效果越大。
圖5. Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像：a左圖為PC-CAR對(duì)SKNAS膠質(zhì)瘤細(xì)胞（呈遞PHOX2B）的殺傷作用明顯，a右圖為PC-CAR對(duì)其他腫瘤細(xì)胞（不呈遞PHOX2B）的殺傷則不明顯；b圖從靶細(xì)胞動(dòng)態(tài)增殖水平來觀察，發(fā)現(xiàn)PC-CAR對(duì)SKNAS等膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯
J Immunother Cancer
CAR親和力并不是越高越好！[3]
大約50%接受抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，因此，迫切需要開發(fā)新的免疫治療靶點(diǎn)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，CD72是B細(xì)胞惡性腫瘤中一個(gè)很有潛力的新靶點(diǎn)。之前發(fā)現(xiàn)的針對(duì)CD72的羊駝來源的納米抗體（NbD4）雖然有效，但是效果不及傳統(tǒng)的針對(duì)CD19的CarT。因此，以NbD4為母本進(jìn)行人源化，產(chǎn)生一系列新的CD72納米抗體。將這些納米抗體插入第二代 CD72 CAR-T 細(xì)胞中，并在體外和體內(nèi)針對(duì) B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和 B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的臨床前模型進(jìn)行評(píng)估。其中一種抗體克隆（H24）顯示出對(duì)B細(xì)胞腫瘤有著增強(qiáng)的殺傷效力，這也包括CD19 CAR-T復(fù)發(fā)后的患者來源樣本。H24 對(duì) CD72 的結(jié)合親和力適中，而進(jìn)一步的提高親和力（KD<1nM）卻不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。
圖6. Octet® 結(jié)果顯示：H24親和力高于母本NbD4，主要是解離速率常數(shù)Koff變小
圖7. Incucyte® 結(jié)果顯示，H24在增加腫瘤細(xì)胞殺傷的同時(shí)（左圖），保持了T細(xì)胞的增殖活性（右圖）
圖8. 對(duì)H24進(jìn)行親和力成熟并提高親和力的抗體NbD4.7,NbD4.13（左圖），并沒有增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性
為什么細(xì)胞治療研究要用
Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)呢？
培養(yǎng)箱內(nèi)可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對(duì)細(xì)胞的傷害；只要放好您的細(xì)胞，其他交給Incucyte® 吧
6個(gè)板位，分別獨(dú)立設(shè)置檢測(cè)程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高
高效簡(jiǎn)便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長(zhǎng)曲線等多指標(biāo)多參數(shù)；本文提到了使用Incucyte® 多個(gè)參數(shù)的監(jiān)控，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確
大于100種優(yōu)化過的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol，文章數(shù)大于12,000篇
為什么要用Octet® 呢？
非標(biāo)記Direct Binding是趨勢(shì)，不需要標(biāo)記和信號(hào)放大，可以更好的保持反應(yīng)物的活性
快速測(cè)定親和力，提供結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)更加定量化地表征分子互作
無洗滌步驟，可測(cè)弱親和力（解離快）
寫入了美國(guó)藥典，文章>12000篇，認(rèn)可度廣
萬金油技術(shù)，可以用于檢測(cè)DNA，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子
操作簡(jiǎn)便，耗材及維護(hù)成本低
在賽多利斯的Octet® 分子互作分析系統(tǒng)和Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像這對(duì)CP的助力下，相信有更多的新型細(xì)胞治療法產(chǎn)生！
實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析開啟免疫細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)新格局
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-參考文獻(xiàn)-
[1] Mandal, K., Wicaksono, G., Yu, C. et al. Structural surfaceomics reveals an AML-specific conformation of integrin β2 as a CAR T cellular therapy target. Nat Cancer 4, 1592–1609 (2023).
[2] Yarmarkovich, M., Marshall, Q.F., Warrington, J.M. et al. Targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs. Nature 623, 820–827 (2023).
[3] Temple WC, Nix MA, Naik A, et al. Framework humanization optimizes potency of anti-CD72 nanobody CAR-T cells for B-cell malignancies. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2023;11:e006985. doi:10.1136/jitc-2023-006985
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