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CRISPR / Cas9編輯系統(tǒng)目前被廣泛應(yīng)用于在hPSCs（多能干細(xì)胞）的特定基因中產(chǎn)生突變，以此模擬體外遺傳疾病的細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染后的混合細(xì)胞群同時包含未編輯和各種編輯的細(xì)胞，需要通過手動稀釋克隆進(jìn)行分離，這個過程既費(fèi)時又費(fèi)力，而且步驟繁瑣。

最近一篇文章^[1]利用賽多利斯CellCelector Flex全自動無損細(xì)胞分離系統(tǒng)在CRISPR / Cas9基因編輯后，從混合細(xì)胞群中高效識別單細(xì)胞，并從這些分離的單細(xì)胞中精確分離單細(xì)胞克隆。那么，這個設(shè)備有什么秘密呢？

秘密1 納米孔板：讓細(xì)胞住上單間

24孔板中的每一個大孔都具有數(shù)千個方形納米孔（體積約為4 nL的微結(jié)構(gòu)）。在這種設(shè)計下，納米孔的存在可以增加孔內(nèi)的細(xì)胞密度，同時確保單個細(xì)胞能通過納米孔壁有效地分離。這使得數(shù)幾千個細(xì)胞能夠在同一大孔中共培養(yǎng)，同時保持其單克隆性，并且擁有更快的增殖速度。每個大孔只需要接種約1000-3000個細(xì)胞，接種細(xì)胞按照泊松分布隨機(jī)分布在納米孔中，因此，至少約30%的納米孔會被單細(xì)胞占據(jù)，從而大大提高單細(xì)胞的分離效率。

 

 

圖1. CellCelector Flex全自動無損細(xì)胞分離系統(tǒng)和24孔納米孔板：

A.每個納米孔形成一個正方形（200×200 μm），由100 μm高的壁界定；

B. 系統(tǒng)能自動拼接整個孔圖像并自動分割納米孔，在每個代表性孔中，軟件能通過分割識別2,263個方形納米孔，每個識別的納米孔都用紅線包圍，并分配一個唯一ID，以便在實(shí)驗中實(shí)現(xiàn)可追溯性；C. CellCelector Flex 概述：（a） 倒置熒光顯微鏡和電動載物臺;（b）終板工作臺和（c）帶有高精度玻璃毛細(xì)管的單細(xì)胞挑取機(jī)械臂（放大視角見圖D.）；

E. 系統(tǒng)俯視圖：平臺由專用區(qū)域組成，（a）源板工作臺（b）滅菌罐和（c）廢物容器

 

秘密2自動識別單克隆孔

為了驗證該系統(tǒng)識別、篩選和挑取hPSC克隆方面的能力，文中生成了兩個具有整合GFP或mCherry基因的hPSC細(xì)胞系，并將轉(zhuǎn)基因插入到腺相關(guān)病毒整合位點(diǎn)1（AAVS1）位點(diǎn)。以等比例混合無標(biāo)記，分別表達(dá)GFP和mCherry的hPSC，然后將它們接種到納米孔中。在D0（第0天），使用CellCelector Flex系統(tǒng)自動掃描接種了細(xì)胞的納米孔。然后使用CellCelector Flex軟件的特定圖像分析算法（包括設(shè)定單細(xì)胞大小和球形度等參數(shù)閾值）對D0的單細(xì)胞納米孔進(jìn)行鑒定。在挑選前的第3-5天，我們再次掃描納米孔板，系統(tǒng)會根據(jù)其生長自動選擇單細(xì)胞來源的細(xì)胞克隆團(tuán)，并提供基于圖像的單克隆證明。文章使用CellCelector Flex玻璃毛細(xì)管挑頭對細(xì)胞克隆團(tuán)進(jìn)行挑取，并將其接種在96孔板中。在培養(yǎng)過程中，可以使用Incucyte® 實(shí)時活細(xì)胞分析系統(tǒng)跟蹤細(xì)胞的生長。

秘密3 溫和挑取細(xì)胞，無交叉污染

文章中作者還探究了單細(xì)胞挑取過程中大家最為關(guān)心的交叉污染問題。由于玻璃毛細(xì)管在每次取樣之間不會更換，設(shè)計實(shí)驗評估了使用同一毛細(xì)管連續(xù)取樣和接種細(xì)胞克隆團(tuán)是否會導(dǎo)致交叉污染。連續(xù)挑取無標(biāo)記、GFP 或 mCherry 熒光的細(xì)胞克隆團(tuán)并接種。細(xì)胞增殖后，在接種孔里沒有觀察到細(xì)胞克隆團(tuán)的熒光顏色混合。因此，連續(xù)提取不同的細(xì)胞克隆團(tuán)不會引起交叉污染。并且?guī)缀跛刑羧〗臃N后的培養(yǎng)孔里的細(xì)胞克隆團(tuán)都進(jìn)行了增殖，也說明挑取和接種不會影響細(xì)胞活性。

文章最后用免疫熒光觀測和測序驗證了挑取后干細(xì)胞的多能性和基因整合度。

這樣的系統(tǒng)，做干細(xì)胞的你怎能不愛？