幾十年來，科學家們一直致力于研究溶血對器官的損傷作用，但仍未完全發(fā)現(xiàn)驅(qū)動這種病理現(xiàn)象的內(nèi)在機制。
近期，來自美國圣裘德兒童醫(yī)院的研究人員在Cell上發(fā)表了題為“NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs”的文章[1]，尋找到一種先天免疫模式識別受體NLRP12，是誘導炎癥細胞死亡和病理的關(guān)鍵分子。
值得注意的是，在文章中，Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)顯著地推動了這項研究，并承擔了整個實驗約80%的工作量，成為構(gòu)筑論文主體的關(guān)鍵工具。那么，文章是如何應(yīng)用Incucyte® 的呢？
先天免疫是由病原體、病原相關(guān)分子模式（PAMP）或損傷相關(guān)分子模式（DAMP）激活引起的，增強的免疫激活可導致細胞損傷、組織破壞和器官損傷，以及DAMP的釋放（圖1）。模式識別受體（PPR）因其可以感知非特異性PAMP或DAMP的能力而被經(jīng)典研究，然而，多種PAMP和DAMP對PRR的聯(lián)合激活尚未得到很好的表征。
圖1. 紅細胞破裂、DAMP釋放、聯(lián)合PAMP激發(fā)下游信號通路導致細胞死亡
萬事開頭難，研究人員首先需要建立體外模擬感染并驅(qū)動先天免疫和炎癥細胞死亡的模型。如圖2所示，研究人員選擇多種DAMP、PAMP及其組合的誘導細胞死亡的分子，以骨髓源性巨噬細胞(BMDM)為模型，應(yīng)用Incucyte® 檢測（圖2），結(jié)果顯示：單獨的PAMP Pam3、poly(I:C)、LPS或R848處理骨髓源性巨噬細胞(BMDM)，觸發(fā)死亡比例低。然而，組合PAMP在許多組合中都會誘導大量細胞死亡（圖2）。同樣，單個DAMP不會誘導BMDM中的細胞死亡，DAMP的組合也不會誘導細胞死亡。PAMP與DAMP的組合中血紅素與Pam3、LPS或R848的組合細胞死亡反應(yīng)強烈。由此表明，由特定PAMP組合驅(qū)動的信號傳導以及血紅素與PAMP的組合可以誘導強烈的細胞死亡。
圖2. 各種誘導劑組合的細胞死亡代表性圖片以及定量圖；Incucyte® 可以自動獲取48小時內(nèi)PI染色的圖像，允許明場和熒光通道的重疊，并標記陽性信號，通過設(shè)定分析閾值和背景扣除算法，自動定量分析PI陽性細胞的比例
遵循圖1的研究路線，接下來的任務(wù)是通過干擾中間受體和信號分子，來探究是否能改變細胞死亡的表型。在這一步驟中，Incucyte® 的高通量自動成像和分析功能將全面支持本文的研究，全程自動記錄并分析細胞死亡的比例。
Incucyte® 不僅可檢測常規(guī)細胞死亡，使用特殊活細胞檢測試劑，還可檢測線粒體ROS產(chǎn)生。血紅素暴露通過產(chǎn)生活性氧(ROS)觸發(fā)巨噬細胞中的細胞死亡。血紅素加PAMP刺激導致BMDM中線粒體ROS(mitoROS)的產(chǎn)生（圖3AB）。使用ROS清除劑N-乙酰L-半胱氨酸(NAC)進行處理可顯著防止細胞死亡（圖3C），表明ROS產(chǎn)生與誘導細胞死亡之間存在機制聯(lián)系。
圖3. (A) ROS熒光及明場代表性圖片由Incucyte® 直接導出；(B) Incucyte® 計算紅色熒光強度值；(C) NAC消除劑可防止細胞死亡
在這篇文章中，無論是測試病原相關(guān)分子模式（PAMP）、損傷相關(guān)分子模式（DAMP）及其組合對細胞死亡的影響，還是后續(xù)干擾中間信號分子以觀察細胞死亡情況，都涉及到濃度和時間點的精準控制。這時，Incucyte® 的實時監(jiān)測功能就大顯神威了，它可以實時檢測并確定細胞死亡的最高時間點和最佳濃度，顯著降低實驗工作量，提高科研效率。
每當我推薦Incucyte® 時，總會問一個問題：這臺設(shè)備能實現(xiàn)什么其他設(shè)備無法做到的?這篇文章可能就是答案。
科研工作常常是在最后的20%時間獲取80%的結(jié)果，大部分時間都處于探索和摸索階段。而Incucyte® 的優(yōu)勢便是能大幅度縮短這一探索階段的時間。
這項新研究確定NLRP12在誘導炎癥細胞死亡質(zhì)膜破裂從而致病的關(guān)鍵因子，那么其作為藥物靶標，可有效減少器官損傷。接下來，讓我們看另一篇文章是如何直接利用基礎(chǔ)機制設(shè)計抗體藥物，來接抑制程序性細胞死亡的質(zhì)膜破裂進而減弱炎癥反應(yīng)，削弱病理損傷的。
關(guān)于細胞質(zhì)膜破裂（PMR）有一個有趣的觀點轉(zhuǎn)變。過去的觀點認為，PMR是一個由滲透壓變化引起的被動過程，細胞是“脹”破的；然而，這個觀點在21年被推翻了。進一步研究表明：質(zhì)膜破裂及LDH和DAMP的釋放需要一種名為NINJ1的蛋白參與，如果該蛋白發(fā)生突變，PMR就不會發(fā)生。因此，我們是否能夠通過抑制NINJ1來限制過度細胞死亡的質(zhì)膜破裂呢？
Kayagaki等人在Nature發(fā)表題為“Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury”的文章，證實了之前提出的設(shè)想，即使用NINJ1抗體可以抑制程序性細胞死亡的質(zhì)膜破裂[2]。
為了生產(chǎn)NINJ1阻斷抗體，使用全長NINJ1對NinJ1−/−小鼠免疫接種，分離15000個IgM陰性-B細胞，對篩選到的217種重組抗小鼠NINJ1 IgG2a單克隆抗體進行功能篩選，確定clone D1（Ninj1-575）是NINJ1依賴性PMR的抑制劑（圖4A）。同時，clone D1抑制了HEK293T細胞中小鼠NINJ1（而非人NINJ1）異位表達引起的膜損傷（圖4B）。
圖4.(A) NINJ1阻斷抗體篩選及生產(chǎn)流程；
圖4.(B) 阻斷抗體D1抑制異位表達導致的膜損傷，Incucyte® 實時檢測分析每半小時YOYO+細胞比例
之后，研究人員又使用FITC標記的150kDa dextran導入BMDM細胞作為工具，當質(zhì)膜破裂，熒光信號消失。與同種型對照抗體相比，克隆D1以劑量依賴性方式降低BMDM中的PMR，克隆25表現(xiàn)出質(zhì)膜破裂阻斷活性，但不如克隆D1有效（圖5）。
圖5. Incucyte® 每半小時檢測一次DD150陽性細胞比例，質(zhì)膜破裂的細胞為陰性細胞，藍色為Clone D1曲線，0.1μg/ml濃度就能達到很好的抑制效果。
本研究為從基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化提供了一種高效的研究策略框架。在確定導致疾病的關(guān)鍵病因后，尋求阻斷策略便是首要任務(wù)。對于細胞表面分子，最直接的策略便是利用專一抗原的抗體來抑制其作用。在這個過程中，可以利用iQue® 高通量流式細胞儀在短短5分鐘內(nèi)完成96孔板的B細胞篩選。同時，在抗體生產(chǎn)過程中，親和力和濃度是最關(guān)鍵的兩點，Octet® 非標記分子互作系統(tǒng)的檢測可以提供精準信息。最后，驗證抗體效果時，我們會使用Incucyte®，該設(shè)備能夠?qū)崟r監(jiān)測細胞的增殖和死亡等指標。
為什么如此多CNS文章選用Incucyte® 來進行活細胞成像實驗?zāi)兀?/strong>
長時程，不閑置：培養(yǎng)箱內(nèi)可長達數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔自動拍攝，減少人力，防止過多操作對細胞的傷害
通量高，通用性強：6個板位，分別獨立設(shè)置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿；
智能化拍攝，AI分析：高效簡便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標多參數(shù)；
完整解決方案：大于100種優(yōu)化過的活細胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol；文章數(shù)大于14,000篇，是長時間活細胞成像產(chǎn)品
多種應(yīng)用的配套拍攝模式：針對3D類器官/腫瘤球、線粒體膜電位、神經(jīng)突、血管生成等應(yīng)用都有配套的拍攝及分析模式
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-參考文獻-
[1] NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs. Cell. 2023 Jun 22;186(13):2783-2801
[2] Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury. Nature. 2023 Jun;618(7967):1072-1077.
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