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由于細胞容易受到細胞處理的物理方式及用于培養(yǎng)物接種及填充的實驗室設(shè)備帶來的影響，因此在細胞培養(yǎng)應(yīng)用中應(yīng)避免塑料實驗室用具產(chǎn)生的浸出化合物。賽多利斯移液器多款吸頭釋放的浸出物含量極低，即使在苛刻的酸性或溶劑條件下也遠低于能夠?qū)毎】祷蛏餃y定產(chǎn)生影響的水平。

下載本篇《細胞培養(yǎng)技術(shù)和實驗室耗材在確保最佳細胞健康中的重要作用》應(yīng)用說明，了解賽多利斯移液器吸頭低浸出物含量對細胞培養(yǎng)過程的重要作用。

細胞培養(yǎng)應(yīng)用在研發(fā)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，許多因素都會影響體外培養(yǎng)細胞的健康，其中包括從用于細胞接種、補料和處理的耗材中的浸出物。浸出物是指在標準使用和儲存條件下從塑料實驗室耗材中釋放出的化合物和微量金屬。表1 中列出了的文獻闡述了不同塑料浸出物對細胞生長、形態(tài)和功能的具體影響。

考慮到這些風(fēng)險，需要在細胞培養(yǎng)工作流程的每個步驟中盡可能減少可能存在的浸出物。為確保在細胞培養(yǎng)流程中細胞的健康，我們通過多種方法，測試了不同移液器吸頭的表現(xiàn)。

測試的方法如下

移液器吸頭的微量金屬浸出物分析

將二次蒸餾濃縮的HNO3（100μL）吸入至200μL 賽多利斯Optifit 吸頭、Safetyspace® 濾芯吸頭和及其低吸附吸頭型號中，保持5 秒鐘，然后分配到酸洗樣品管中。然后將排出的溶劑再次吸入至相同的移液器吸頭，并分配到相同的酸洗樣品管中。對每個移液器吸頭重復(fù)該浸出循環(huán)共十次。使用超純水將每個樣品管中的溶液稀釋至1N HNO3 濃度。使用ICP-MS，根據(jù)標準曲線分析樣品。使用Nu AttoM SC-ICPMS對所有樣品進行分析。使用1ppm的多元素亞組分溶液制備1000ppt、100ppt 和10ppt 標準品。在低分辨率模式下，在10個周期內(nèi)進行500 次10ms 的掃描，在峰值跳躍模式下進行分析。

移液器吸頭的浸出化合物分析

使用100μL 乙醇或二甲基亞砜清洗200μL Optifit 吸頭、Safetyspace® 濾芯吸頭及其低吸附型號，具體方法為將溶劑吸入移液器吸頭，保持5 秒鐘，然后直接分配到樣品管中。使用多個相同類型的移液器吸頭（五個移液器吸頭，共500μL，混合樣品）生成足以通過GC-MS 或LC-MS 進行化學(xué)浸出物分析的測試體積。

GC-MS

通過液- 液萃取制備乙醇和水提取物，并進樣至Clarus 600GC-Clarus 600T MS Turbo 和C18 Elite-5MS（60m×0.25mm×0.25μm）色譜柱。通過使用內(nèi)標2- 氟聯(lián)苯（10μg/ml）進行液體注射，使用甲苯 -d8（ 0.1μg/ml）進行頂空注射，進行半定量。

細胞培養(yǎng)

將小鼠 B16F10（ATCC® CRL6475™）細胞以不同密度接種在 96 孔板上，使用單道Picus® Nxt50-1000μL 移液器制備細胞系列稀釋液（1:2 稀釋）。使用 Picus® Nxt 5-120μL 和 10-100μLTacta® 移液器完成培養(yǎng)板接種（100μL/ 孔）。根據(jù)制造商的說明，在接種后 24 小時，采用基于甲瓚的分析測定細胞存活能力。在補充有 10% 胎牛血清和 100U/mL 青霉素鏈霉素Dulbecco 改良 Eagles 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。

 

基于上述方法得出如下結(jié)果

1、移液器吸頭含有極少量的微量金屬

表3 列出了由吸頭制造商提供的一些微量金屬濃度和檢測限數(shù)據(jù)。根據(jù)表2 中的細胞毒性微量金屬水平來評估這些濃度和檢測限時，表3 中的某些值和檢測水平顯然超過了表2 中的細胞毒性值。在對比不同制造商的合格證書時，務(wù)必注意其中的檢測水平和檢測方法；微量金屬測試限值應(yīng)較低，并與金屬可能的細胞毒性水平保持一致。

表2：金屬的細胞毒性濃度示例

表3：賽多利斯和其他制造商移液器吸頭的微量金屬測試結(jié)果和檢測水平示例（μg/mL=ppm）

 

2、浸出化合物的含量低于干擾水平

使用 GC-MS 對低吸附吸頭中的對己二酸乙酯進行定量，最大濃度為 0.25ppm。檢測到一種保留時間為 8.32 分鐘的未知化合物，其最大濃度為 0.13ppm，但由于結(jié)構(gòu)信息不充分，所以無法對其進行表征。未檢測到超出其定量限的其他化合物（表 4）。

 

表4：賽多利斯移液器吸頭化學(xué)浸出物

*低于定量限 †低于檢測限

‡分析中沒有樣品的DiHEMDA 呈陽性，因此未確定 LOQ

3、賽多利斯低吸附移液器吸頭的安全性和耐用性

下圖顯示了一項研究結(jié)果，該研究比較了不同 LR 移液器吸頭在低吸附性能穩(wěn)定性方面的差異。用溶劑（異丙醇、丙酮或二甲基甲酰胺）清洗吸頭 20 次，然后用水清洗三次。完成清洗步驟之后，通過測定移液后吸頭中殘留液體的量來測試吸附情況。使用賽多利斯低吸附吸頭時，溶劑處理后的殘留液體量始終較低。即使是標準（非 LR）賽多利斯移液器吸頭，其表面吸附量也低于許多其他制造商生產(chǎn)的 LR 吸頭。

 

?圖1：低吸附涂層在溶劑處理后的穩(wěn)定性。詳細數(shù)據(jù)請參見賽多利斯低吸附吸頭應(yīng)用說明。

 

總結(jié)

 

賽多利斯吸頭在如下幾方面能夠有效優(yōu)化細胞健康：

• 吸頭釋放的金屬和化學(xué)物質(zhì)水平非常低，因此適用于細胞培養(yǎng)應(yīng)用

• 已證明芥酸酰胺、油酰胺和bDtBPP 對生物測定和細胞生長有負面影響，而賽多利斯移液器吸頭釋放的這些物質(zhì)的水平可以忽略不計

• 低吸附吸頭即使在用溶劑處理后也能保持其低吸附性能

• 吸頭根據(jù)最高品質(zhì)和純度標準制造，因此無需添加潤滑劑（如油酰胺）等添加劑