患者樣本中存在的一些生物分子能夠?yàn)榧膊≡\斷提供關(guān)鍵的檢測(cè)指標(biāo)，例如疾病代謝物和蛋白質(zhì)標(biāo)記物?，F(xiàn)有的分離方法通常采用沉淀法，費(fèi)時(shí)昂貴且要條件優(yōu)化。本文中，我們通過使用 NMR 和 Off-Gel 方法來進(jìn)行評(píng)估，展示了如何通過超濾快速、精確、高效地分離血清中生物分子。
下載本篇《Vivaspin® Turbo 4 PES: 一種分離疾病代謝物和蛋白質(zhì)的經(jīng)濟(jì)方法》應(yīng)用說明，了解超濾系統(tǒng)如何在經(jīng)濟(jì)效益，具有同樣的有效性質(zhì)，簡(jiǎn)單易操作的前提下完成該過程。
目前，人們普遍采用多重親和去除系統(tǒng)(Multiple Affinity Removal System, MARS)從人血清、血漿和其他生物液體中分離高豐度蛋白質(zhì)（白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、轉(zhuǎn)鐵蛋白和結(jié)合珠蛋白）。去除這些高豐度蛋白質(zhì)可以有效地?cái)U(kuò)大動(dòng)態(tài)范圍，從而改善血清樣本的LC/MS和電泳結(jié)果。但是，使用該系統(tǒng)會(huì)給用戶帶來高昂的成本（4×w.r.t.超濾）。
我們通過超濾的方式，以蛋白質(zhì)的大小和結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，在驅(qū)動(dòng)力（通常由離心或壓力條件產(chǎn)生）下將樣品通過膜分離。
具體步驟如下
1、濃縮管制備
用 0.1NHCl沖洗Vivaspin® Turbo 4，重復(fù)沖洗 3 到 4 次。
2、樣品采集、超濾和分析
從患者身上抽取血樣并提取血清
使用 Vivaspin® Turbo 4，50kda MWCO PES（4000g，7min）高豐度血清蛋白
使用 Vivaspin® Turbo 4，3kDa MWCO PES 濃縮濾液（4000g，7min）
濃縮物的Off-Gel進(jìn)行區(qū)帶分離分離（蛋白質(zhì)>3kDa）
超濾透過液的核磁共振（代謝產(chǎn)物<3kDa）
以上步驟即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)從代謝物中分離，但是需要注意的是用去離子水進(jìn)行預(yù)沖洗無法有效去除干擾物，因此在核磁共振圖譜中觀察到雜質(zhì)峰（圖1）。因此使用0.1NHCl溶液進(jìn)行預(yù)沖洗（一個(gè)濃縮管的預(yù)沖洗量為12 ~ 14 mL，是Vivaspin® Turbo 4PES的 3 ~ 4 倍）。
圖1. 核磁共振圖譜
結(jié)論
通過Off-Gel分離對(duì)濃縮物進(jìn)行分析（圖2），含有小代謝物的濾液則通過核磁共振進(jìn)行分析（圖3）。因此超濾方式是簡(jiǎn)單高效的，對(duì)一個(gè)樣本的分析成本估計(jì)會(huì)是MARS的四分之一。
（左）圖2. 對(duì)健康個(gè)體（頂部）和患病個(gè)體（底部）的 血清中蛋白質(zhì)進(jìn)行的Off-Gel分離分析
（右）圖3. 對(duì)健康個(gè)體（頂部）和患病個(gè)體（底部）血清中代謝物進(jìn)行的核磁共振分析
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