化工儀器網(wǎng)技術(shù)文章
人丙型肝炎IgG抗體ELISA試劑盒使用說明書
閱讀：1187 發(fā)布時間：2020-8-4人丙型肝炎IgG抗體（HCV-IgG）試劑盒（ELISA）
使用說明書
本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人丙型肝炎IgG抗體（HCV-IgG）的含量。
有效期：6個月
保存條件：2-8℃
本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷
實驗原理
試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人丙型肝炎IgG抗體（HCV-IgG）捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人丙型肝炎IgG抗體（HCV-IgG）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
樣本處理及要求
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
需要而未提供的試劑和器材
1.酶標(biāo)儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
微孔酶標(biāo)板
12孔×8條
12孔×4條
無
標(biāo)準(zhǔn)品
0.3mL*6管
0.3mL*6管
無
樣本稀釋液
6mL
3mL
無
檢測抗體-HRP
10mL
5mL
無
20×洗滌緩沖液
25mL
15mL
按說明書進(jìn)行稀釋
底物A
6mL
3mL
無
底物B
6mL
3mL
無
終止液
6mL
3mL
無
封板膜
2張
2張
無
說明書
1份
1份
無
自封袋
1個
1個
無
備注：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為： 16、 8、4、2、 1、0.5 U/mL
2. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實驗。
注意事項
1.嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
5.避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
9.不能使用過期產(chǎn)品。
10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準(zhǔn)備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
實驗結(jié)果計算
以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。
試劑盒性能
1.檢測范圍：0.5 U/mL – 16 U/mL。
2.靈敏度：低檢測濃度小于0.1 U/mL。
3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4.重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。
說明
由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。
1.終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
2.不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。
3.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到佳的檢測結(jié)果。
4.本公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
5.使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實驗結(jié)果偏差。
6.若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。
7.某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。