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組織結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶（cNOS/NOS3/eNOS）活性熒光定量檢測(cè)

試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

組織結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶（cNOS/NOS3/eNOS）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過一氧化氮合成酶反應(yīng)系統(tǒng)，在內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，由底物L-精氨酸被催化產(chǎn)生一氧化氮，進(jìn)而與熒光探針二氨基熒光素反應(yīng)，生成強(qiáng)烈熒光產(chǎn)物三唑并熒光素，通過其相對(duì)熒光峰值的變化，即采用熒光法來測(cè)定樣品中結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體、昆蟲等）的結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶的特異活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase；NOS；EC1.14.13.39）是鈣調(diào)蛋白（calmodulin）依賴性或含鈣調(diào)蛋白的細(xì)胞色素p450類血紅素蛋白（hemoprotein），分子量為130至160KD的二體蛋白，其催化結(jié)構(gòu)域包括還原酶、加氧酶、黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide；FAD）、核黃素單苷酸（flavin mononucleotide；FMN）等要素，在輔助因子四氫生物喋呤（tetrahydro-biopterin）的幫助下，進(jìn)行非芳香類氨基酸L-精氨酸（L-arginine）的5’端電子氧化。一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端的氮原子，在還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）和氧氣的參與下，成為一氧化氮（nitric oxide）的合成反應(yīng)。一氧化氮合成酶有三種異構(gòu)體：神經(jīng)元型（neuronal NOS；nNOS；）、內(nèi)皮細(xì)胞型（endothelial NOS；eNOS；NOS3）和巨噬細(xì)胞型（macrophage NOS；mNOS；NOS2），前二者為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合成酶（constitutive NOS；cNOS），后者為誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible NOS；iNOS）。其中內(nèi)皮細(xì)胞型（eNOS）為膜相關(guān)性蛋白（豆蔻?；?；myristoylation），分布在心血管以及腦血管組織，含有N-末端加氧酶、C-末端還原酶和鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其功能在于作為血管保護(hù)分子，維持血管緊張度（vascular tone）和完整性，同時(shí)受到鈣離子、鈣調(diào)蛋白、磷酸化等調(diào)節(jié)。基于底物L-精氨酸，在eNOS敏感性抑制劑亞胺乙基鳥氨酸（L-N⁵(1-iminoethyl)- L-ornithine；L-NIO）存在與否的情況下，通過NADPH和氧氣的參與，由一氧化氮合成酶催化產(chǎn)生一氧化氮?dú)怏w和瓜氨酸（citrulline）；進(jìn)而使用特異性熒光探針二氨基熒光素（4,5-diaminofluorescein；DAF-2）與一氧化氮反應(yīng)，生成強(qiáng)烈熒光產(chǎn)物三唑并熒光素（triazolofluorescein；DAF-2T），通過其相對(duì)熒光峰值的變化（激發(fā)波長(zhǎng)495nm，散發(fā)波長(zhǎng)515nm），來定量分析結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶的特異活性。其反應(yīng)方式為： 

 

eNOS

L-arginine  +  NADPH  +  O2   →   nitric oxide  +  citrulline  +  NADP

L-NIO

 

DAF-2  +  NO +  O2  →  DAF-2T

   

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  20毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應(yīng)液（Reagent D）   1毫升

顯色液（Reagent E）   250微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F） 100微升

專性液（Reagent G） 100微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存反應(yīng)液（Reagent D）、顯色液（Reagent E）、標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）和專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 顯色液（Reagent E）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

*緩沖液（Reagent H）：用于檢測(cè)純化內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合成酶或體外檢測(cè)

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織樣品

恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

  

一、樣品準(zhǔn)備

 

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗
• （選擇步驟）抽去清理液
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入1毫升裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化（約80下）
• 將所有勻漿物移入2毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取1毫升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作