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技術(shù)文章
了解一下潮霉素B的應(yīng)用有哪些吧
點(diǎn)擊次數(shù)：775 發(fā)布時間：2021-4-23
今天讓我們一起來了解一下潮霉素B的應(yīng)用有哪些吧，話不多說一起看看吧。
1.篩選和維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hph 載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞(植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞);
2.由于作用模式的差異，常與G418 (GeneticinTM)，Zeocin™和blasticidin S聯(lián)合使用，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩個不同載體的細(xì)胞株;
3.抗病毒劑，由于潮霉素B選擇性滲透進(jìn)入病毒感染增強(qiáng)通透性的細(xì)胞，而且具有抑制翻譯的功效;
4.作為驅(qū)蟲藥加入動物飼料;
5.雙抗性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選的抗生素作用機(jī)制及抗性
6.抗生素抗性機(jī)制抗性基因哺乳動物篩選濃度
i.潮霉素B干擾70S核糖體易位和誘導(dǎo)對mRNA模板的錯讀Hph 200~500μg/mL;
ii.G418干擾80S核糖體功能和抑制蛋白合成Tn5/Tn60 1100~1000μg/mL;
iii.Zeocin摻入或者切割DNA引起細(xì)胞死亡Sh ble 50~100μg/mL;
iv.blasticidin S核糖體上抑制肽鍵形成Bsd/BSD 3~50μg/mL。
1.案例一：殺滅曲線確定最佳殺死濃度(僅作參考)
i.往組織培養(yǎng)級的96孔板內(nèi)加入未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞密度約50-200細(xì)胞/孔;細(xì)胞貼壁之后，往每孔加入含不同濃度(如50-1000μg/mL，至少5個濃度)潮霉素B的200μL新鮮培養(yǎng)基;
ii.37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞10-14天;
iii.培養(yǎng)5-7天后更換新的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液內(nèi)含有相應(yīng)濃度的潮霉素B;
iv.10-14天后使用細(xì)胞增殖方法如MTT，CCK-8等評估細(xì)胞活力;也可以通過檢測細(xì)胞克隆數(shù)或百分比匯合率來確定毒性效應(yīng)。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細(xì)胞的最小濃度為最佳篩選濃度。
2.案例二：篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞
i.對于貼壁細(xì)胞，直接吸去60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后加入含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基5-6ml;對于懸浮細(xì)胞，無菌條件250x g,離心10min除去舊的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后懸浮在約5ml的含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;
ii.5-7天后，如上方法更換含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;
iii.再孵育細(xì)胞5-7天;
iv.10-14天孵育后，培養(yǎng)體系中只含有能夠表達(dá)潮霉素B抗性表型的活細(xì)胞。因此篩選之后如步驟