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禽流感病毒檢測(cè)技術(shù)的研究新進(jìn)展

2013-4-4　　閱讀(1361)

禽流感（ＡＩ）是由Ａ型流感病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）的感染和／或疾病綜合癥。禽流感病毒屬正黏病毒科流感病毒屬，典型病毒粒子為球形，直徑８０～１２０ｎｍ，有時(shí)呈絲狀體等形態(tài)。至今已發(fā)現(xiàn)Ａ型流感病毒的血凝素（ＨＡ）有１６種，神經(jīng)氨酸酶（ＮＡ）有９種（傅生芳，２００５），根據(jù)表面糖蛋白ＨＡ和ＮＡ的抗原性差異可以分為１６個(gè)ＨＡ亞型和９個(gè)ＮＡ亞型，不同亞型病毒之間可以通過交換某些基因片段發(fā)生基因重排，出現(xiàn)具有新的生物學(xué)特征的病毒，因此，ＡＩＶ zui顯著的生物學(xué)特征之一就是亞型眾多。而且，不同亞型或血清型之間無交叉反應(yīng)性或反應(yīng)性低，這使得禽流感的診斷監(jiān)測(cè)工作較為困難。禽流感根據(jù)ＡＩＶ致病力的強(qiáng)弱可分為高致病性（ＨＰＡＩＶ）和低致病性（ＬＰＡＩＶ），前者不僅可以引起家禽死亡，還可以造成人的感染死亡，因此，控制ＡＩＶ的發(fā)生和流行具有重要意義。文章就禽流感近幾年的研究，尤其是在病原學(xué)檢測(cè)、免疫分

析方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法的研究進(jìn)行了綜述。

１　病原學(xué)檢測(cè)

１．１　病毒的分離鑒定
ＡＩＶ在雞胚中生長(zhǎng)良好，將疑似病料經(jīng)適當(dāng)處理接種在９～１０日齡的雞胚中，分離培養(yǎng)病毒。若檢測(cè)出有凝血活性，可進(jìn)一步確定分型；若無凝血活性，則認(rèn)為未分離到病毒（趙翠燕等，２００３），該方法具有、敏感的優(yōu)點(diǎn)，但操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，需要１周左右的時(shí)間。

１．２　電鏡技術(shù)　
利用電鏡技術(shù)可以直觀準(zhǔn)確地鑒別病毒，根據(jù)病毒自身的形態(tài)、結(jié)構(gòu)等不同特征，能很快做出診斷。檢驗(yàn)結(jié)果與樣品制備技術(shù)、收取病料的部位和時(shí)間有關(guān)，電鏡法不能用于亞型及致病性的測(cè)定且其受到設(shè)備的限制，投入資金較大（劉志杰等，２０１１）

２　免疫分析技術(shù)

２．１　免疫傳感技術(shù)　
隨著生物傳感器的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了生物傳感器微陣列、微系統(tǒng)，該技術(shù)靈敏度高、響應(yīng)快，不需要標(biāo)記，既可定性又可定量，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、昂貴、標(biāo)記及操作繁瑣等缺點(diǎn)，具有極廣泛的發(fā)展前景及臨床使用價(jià)值，成為生物傳感器領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)（姚春艷等，２００６）。免疫識(shí)別膜的固定化技術(shù)是生物傳感器制作的核心部分，其固定化技術(shù)決定著生物傳感器的選擇性、靈敏度、穩(wěn)定性和壽命等主要性能，也決定著生物傳感器是否有研究和應(yīng)用價(jià)值。詹愛軍等（２００９）將石英晶片諧振的高靈敏度與免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合，用蛋白Ａ（ＳＰＡ）在鍍金膜的石英晶體電極偶聯(lián)抗Ｈ９亞型流感病毒的單抗構(gòu)建傳感器探頭形成免疫傳感器。檢測(cè)結(jié)果表明，該方法具有較好的特異性，不與Ｈ５亞型禽流感病毒和新城疫病毒（ＮＤＶ）反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到２０ＥＩＤ５０，組成的檢測(cè)器對(duì)相應(yīng)的流感病毒響應(yīng)良好，該法與雞胚病毒分離法檢出流感病毒的符合率達(dá)到９１％。林向華等（２００９）以ＡＴ切型、基頻１０ＭＨｚ的石英晶體為材料，設(shè)計(jì)四通道芯片微陣列。采用聚乙烯亞胺黏附—戊二醛交聯(lián)法

將禽流感Ｈ５、Ｈ９亞型單克隆抗體固定在石英晶體的金膜電極表面制備生物敏感膜，構(gòu)建可用于同步檢測(cè)禽流感Ｈ５、Ｈ９亞型的壓電免疫芯片。構(gòu)建的壓電免疫芯片用于檢測(cè)Ｈ５、Ｈ９亞型抗原和疑似樣品，其各自的響應(yīng)值與空白對(duì)照的噪聲值之比均大于２，試驗(yàn)構(gòu)建的壓電免疫芯片可用于禽流感Ｈ５、Ｈ９亞型的定性檢測(cè)。

２．２　蛋白質(zhì)芯片技術(shù)　
蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高通量、高靈敏度、自動(dòng)化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，在蛋白質(zhì)組的功能研究、疾病診斷及藥物開發(fā)中顯示出巨

大的應(yīng)用潛力（Ｓａｎｇ等，２００８）。石霖等（２００９）制備了可以同時(shí)鑒別診斷禽流感（ＡＩ）、新城疫（ＮＤ）２種

禽病血清抗體的可視化蛋白質(zhì)芯片，將芯片與待檢血清雜交后，再與膠體金標(biāo)記的二抗雜交，銀染顯色后根據(jù)灰度值判定結(jié)果，該可視化蛋白質(zhì)芯片具有很好的特異性，?Z?X暅并且檢測(cè)靈敏度是瓊脂糖凝膠擴(kuò)散（ＡＧＰ）方法的４００倍以上。研究結(jié)果表明，該方法可用于同步鑒別兩種禽病，是一種有效的抗體檢測(cè)新方法。該技術(shù)不僅保留了抗原—抗體反應(yīng)快速、靈敏和特異性的特點(diǎn)，還可以滿足生物樣本多指標(biāo)分析的需要，因此更利于大規(guī)模推廣應(yīng)用（Ｓｍｉｔｈ等，２００６）。

２．３　膠體金免疫層析法　
陳洪等（２００７）用膠體金顆粒標(biāo)記Ｈ５亞型禽流感病毒單克隆抗體Ａ（Ｂ５Ｃ７），用羊抗鼠ＩｇＧ和Ｈ５亞型禽流感病毒單克隆抗體Ｂ（３Ｃ４）噴涂于硝酸纖維膜質(zhì)控線和檢測(cè)線上，研制出Ｈ５亞型禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試紙條。用禽流感Ｈ
５、Ｈ９標(biāo)準(zhǔn)抗原和新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原作為檢測(cè)抗原對(duì)研制的試紙條進(jìn)行特異性、敏感性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。單抗介導(dǎo)的斑點(diǎn)免疫金滲濾法（ＤＩＧＦＡ）是利用Ａ型禽流感單克隆抗體和膠體金標(biāo)記技術(shù)建立的快速檢測(cè)ＡＩＶ方法。敏感性高于ＨＡ診斷方法，２０～３０ｍｉｎ即可出結(jié)果，ＤＩＧＦＡ具有不需試驗(yàn)設(shè)備、可用肉眼判定、方法簡(jiǎn)便、試劑用量少、對(duì)人體無害等優(yōu)點(diǎn)（雷彩俠，２００７）。

２．４　熒光抗體試驗(yàn)
免疫熒光技術(shù)（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ，ＩＦＡ）是利用被標(biāo)記上熒光色素的抗原（或抗體）特異性地與抗體（或抗原）結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)來進(jìn)行觀察的檢測(cè)方法。zui早用于鑒定ＡＩＶ的ＮＰ和ＭＰ抗原，１９６１年開始用于人類流感的快速診斷。秦愛建等（２００３）研制了抗禽流感Ｈ５和Ｈ９亞型病毒的單克隆抗體，建立了免疫熒光方法檢測(cè)ＡＩＶ，可以檢測(cè)出相應(yīng)的Ｈ５亞型病毒。建立在單克隆抗體基礎(chǔ)上的免疫熒光方法具有快速、簡(jiǎn)便、易行、較敏感等特點(diǎn)，也常用于臨床診斷，但出現(xiàn)假陽性的幾率較高。

２．５　單克隆抗體技術(shù)　
李娜等（２００７）利用禽流感Ｈ９亞型病毒（ＡＩＶ－Ｈ９）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得了５株特異性抗ＡＩＶ核蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株。這５株單克隆抗體能與所有試驗(yàn)的ＡＩＶ－Ｈ９病毒反應(yīng)，Ｗｅｓｔｅｒｎ

ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法鑒定結(jié)果表明，單克隆抗體僅識(shí)別６０ｋｕ的蛋白抗原，而不與新城疫病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒、傳染性法氏囊病毒等反應(yīng)。初步應(yīng)用結(jié)果顯示，以這些單克隆抗體建立的間接免疫熒光試驗(yàn)或ＥＬＩＳＡ方法可迅速檢測(cè)出禽流感病毒，這些單克隆抗體在禽流感的預(yù)防監(jiān)測(cè)中將發(fā)揮重要的作用。

２．６　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)（ＥＬＩＳＡ）創(chuàng)立于１９７１年，１９７４年Ｊｅｎｎｉｎｇｓ等首先用ＥＬＩＳＡ對(duì)注射流感病毒所產(chǎn)生的抗體消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行了檢測(cè)。ＥＬＩＳＡ具有較高的敏感性，既可以檢測(cè)抗體，又可以檢測(cè)抗原，且結(jié)果易于分析，在流感的控制、撲滅和檢疫中用途很大。Ｗｕ等（２００７）運(yùn)用表達(dá)的核蛋白（ＮＰ）建立了禽流感抗體定量間接ＥＬＩＳＡ檢測(cè)技術(shù)。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有成熟的禽流感抗原抗體檢測(cè)試劑盒出售，在ＡＩＶ流行病學(xué)普查及早期診斷上起到了重要的作用。李海燕

等（１９９９）在禽流感全病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ＥＬＩＳＡ）和斑點(diǎn)ＥＬＩＳＡ研究的基礎(chǔ)上，建立了以桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的ＡＩＶ核蛋白為抗原的禽流感間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)（ＲＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。此法不僅具有與ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ同樣的特異性和敏感性，而且具備了抗原制備工藝簡(jiǎn)單、生物安全度高、成本價(jià)廉、易于生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

２．７　瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)　
瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)（ａｇａｒｇｅｌｉｍｍｕｎｏｄｆｆｕｏｎ，ＡＧＩＤ）是一種定性的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便，不需要特殊設(shè)備，且有較好的特異性和檢出率。唐松元等（２００７）采用ＡＧＰ檢測(cè)雉類患疑似禽流感?。保咐?，陽性檢出率１００％，用ＨＡ、ＨＩ驗(yàn)證試驗(yàn)符合率為１００％，從而建立一種簡(jiǎn)易、快速、準(zhǔn)確的診斷方法，為快速檢測(cè)本病提供可靠依據(jù)。

２．８　乳膠凝集試驗(yàn)
乳膠凝集試驗(yàn)（ＬＡＴ）主要用來檢測(cè)ＩｇＭ抗體，其特點(diǎn)敏感性不如經(jīng)典的ＨＩ試驗(yàn)，但由于不需要較高的試驗(yàn)技術(shù)和特定的儀器設(shè)備，簡(jiǎn)單、快速，可方便地用于臨床診斷和生產(chǎn)實(shí)踐。喻正軍等（２００５）以羧化的聚苯乙烯乳膠為載體，采用了共價(jià)偶聯(lián)的技術(shù)，經(jīng)雙功能試劑將ＡＩＶ的ＨＡ抗原表達(dá)產(chǎn)物和羧基化的乳膠共價(jià)偶聯(lián)起來，對(duì)血清中特異性ＨＡ抗體進(jìn)行檢測(cè)，克服了蛋白質(zhì)致敏普通乳膠時(shí)，致敏抗原量少、不穩(wěn)定，致敏抗原上的蛋白質(zhì)容易脫落等缺點(diǎn)。此外，血凝及血凝抑制試驗(yàn)（ＨＡ，ＨＩ）簡(jiǎn)單、快速、特異性好，但敏感性較差，主要用于ＡＩＶ亞型鑒定和病毒分離鑒定的輔助手段，不能直接檢測(cè)組織液和分泌液中的病毒，并且需要排除新城疫病毒、腺病毒等的干擾，且不能檢出病毒新的ＨＡ亞型。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（ＮＩＴ）主要用于ＡＩＶ的表面抗原神經(jīng)氨酸酶的亞型鑒定，雖不能提供常量法的定量，但卻是Ａ型流感病毒的分類和抗體檢測(cè)的快捷方法，被世界衛(wèi)生組織推薦用于ＮＡ亞型的分類（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，２００８fs19 ）。ＮＩＴ成本較低且有可重復(fù)性，但試驗(yàn)繁瑣，不易掌握，易受病毒ＨＡ抗體的干擾（任麗偉等，２００９）。病毒中和試驗(yàn)（ＮＴ）是zui敏感且特異的血清學(xué)方法，檢出率也相當(dāng)高，雖然它的操作繁瑣且耗時(shí)，但它高度的特異性是*的，很多新的檢測(cè)方法都要以之為標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行比較（楊帆，２００７）。

３　分子生物學(xué)技術(shù)

３．１　ＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)　
ＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)從基因水平檢測(cè)ＡＩＶ?。遥危粱?，具有高度敏感性和特異性，大大縮短了對(duì)ＡＩＶ的檢出時(shí)間。１９８６年，Ｐｅｒｄｕｅ用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＰＣＲ）診斷禽流感，從接種雞胚到獲得結(jié)果僅需６ｈ，大大縮短了禽流感的診斷時(shí)間（廉

慧鋒等，２００４）。國(guó)內(nèi)學(xué)者陳思懷等（２００６）針對(duì)ＮＰ（型診斷）、ＨＡ（亞型診斷）基因設(shè)計(jì)２對(duì)引物，從而

對(duì)Ｈ５、Ｈ６、Ｈ９亞型ＡＩＶ做快速檢測(cè)。馬鳴瀟等（２００５）針對(duì)Ｈ５和Ｈ９兩個(gè)亞型，各設(shè)計(jì)一套特異性的引物，建立了ＲＴ－ＰＣＲ一步法，用于Ｈ５和Ｈ９亞型的鑒別。謝芝勛等成功建立了快速檢測(cè)鑒別ＡＩＶ?。龋?、Ｈ７和Ｈ９亞型的多重ＲＴ－ＰＣＲ方法，對(duì)ＡＩＶ不同亞型ＲＮＡ的zui低檢測(cè)量為１０ｐｇ，不需要對(duì)病原體進(jìn)行分離增殖就可對(duì)臨床疑似ＡＩＶ感染

的樣品或環(huán)境樣品進(jìn)行直接檢測(cè)和鑒別，避免了進(jìn)行ＡＩＶ分離增殖過程中散毒和傳播等風(fēng)險(xiǎn)（龐耀珊等，２００５；Ｃｈｅｎ等，２００８）。

３．２　生物傳感技術(shù)　
傳感器在流感上的應(yīng)用zui初見于２０世紀(jì)９０年代，生物傳感器技術(shù)的發(fā)展能迅速和具體診斷本病，使臨床工作者能迅速確定是否

治療（Ａｍａｎｏ等，２００５）。時(shí)偉杰等（２００９）將Ｇ４ＰＡＭＡＭ固定在玻碳電極表面，然后通過共價(jià)作用固定禽流感病毒探針ｓｓＤＮＡ－１，以［Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３］３＋為指示劑，采用示差脈沖伏安法和交流阻抗法對(duì)ＤＮＡ電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行了表征。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過與雙鏈ｄｓＤＮＡ作用的［Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３］３＋的峰電流信號(hào)的變化，可以識(shí)別和定量檢測(cè)溶液中互補(bǔ)的禽流感病毒ＤＮＡ片段。經(jīng)過條件優(yōu)化，該法測(cè)定ＤＮＡ的濃度線性范圍為１．３×１０－９～６．５×１０－８ｍｏｌ／Ｌ，zui低檢測(cè)限為９．２×１０－１０　ｍｏｌ／Ｌ。

３．３　基因芯片分型技術(shù)　
芯片技術(shù)是融生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和微電子學(xué)一體的高度交叉的新技術(shù)。將大量的核酸分子以大規(guī)模陣列形式排

布在很小的載玻片等載體上，通過與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中被檢分子的數(shù)量。曹三杰等（２００６）制備的ＮＤＶ－ＩＢＶＡＩＶ－ＩＢＤＶ診斷基因芯片質(zhì)量好，可對(duì)ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＡＩＶ和ＩＢＤＶ進(jìn)行診斷檢測(cè)，具有檢測(cè)靈敏性好，特異性高和芯片可重復(fù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)對(duì)３０個(gè)臨床樣品進(jìn)行初步應(yīng)用檢測(cè)，結(jié)果表明該診斷基因芯片技術(shù)與ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)技術(shù)檢出率基本一致，并具有同步診斷檢測(cè)多種疫病的優(yōu)點(diǎn)。Ｘｕｅ等（２００８）通過設(shè)計(jì)ＡＩＶ?。玻祩€(gè)特異性引物和１個(gè)通用引物，經(jīng)ＲＴ－ＰＣＲ或重疊ＰＣＲ擴(kuò)增了這２５個(gè)亞型的ｃＤＮＡ，研制出了一種能檢測(cè)禽流感１６個(gè)ＨＡ和９個(gè)ＮＡ的ＤＮＡ芯片。由于基因芯片技術(shù)特異、敏感且允許同時(shí)掃描成百上千的核苷酸序列，已成為一種具有巨大潛能的禽流感診斷方法。上已經(jīng)有關(guān)于基因芯片技術(shù)在流感亞型鑒別上應(yīng)用的報(bào)道，直接檢測(cè)流感病毒的ｃＤＮＡ技術(shù)將作為流感病

毒亞型鑒別的一種新途徑（王秀榮等，２００５）。

３．４　核酸依賴的擴(kuò)增　
核酸依賴的擴(kuò)增（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ?。螅澹瘢酰澹睿悖澹猓幔螅澹洹。幔恚穑欤椋妫椋悖幔簦椋铮?，ＮＡＳＢＡ）是一種連續(xù)、等溫、基于恒溫反應(yīng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)使用３種（禽類成肌細(xì)胞增多癥病毒反轉(zhuǎn)錄、核糖核酸Ｈ、噬菌體Ｔ７核糖核酸聚合酶）和２種特別設(shè)計(jì)的寡核酸引物。上游引物５′末端包含有噬菌體Ｔ７的依賴于ＤＮＡ的ＲＮＡ聚合的啟動(dòng)子序列，下游引物的５′末端包含有和釕標(biāo)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針（ＥＣＬ　Ｐｒｏｂｅ）互補(bǔ)的序列。在擴(kuò)增步驟中，兩個(gè)５′端都整合進(jìn)擴(kuò)增序列中，從而率生產(chǎn)出互補(bǔ)ＲＮＡ序列的模板。該技術(shù)特點(diǎn)是整個(gè)擴(kuò)增過程在恒溫條件下進(jìn)行，不受背景中ＤＮＡ的干擾，不易發(fā)生交叉污染，擴(kuò)增效率高于ＰＣＲ，特異性好，不需要特殊（如ＰＣＲ儀）的控溫裝置，檢測(cè)禽流感群特異性毒株（Ｈ１、Ｈ１５）（ＮＡＳＢＡ－ＡＩＶ）、Ｈ５亞型（ＮＡＳＢＡＨ５）、Ｈ７亞型（ＮＡＳＢＡ－Ｈ７）的ＮＡＳＢＡ／ＥＣＬ檢測(cè)

試劑盒，與現(xiàn)行的病毒培養(yǎng)檢測(cè)方法的靈敏度相當(dāng)，可以同時(shí)檢測(cè)５０個(gè)樣本，進(jìn)行大規(guī)模檢樣（劉樂庭，２００５）。目前已標(biāo)準(zhǔn)化的有《Ｈ５亞型禽流感病毒ＮＡＳＢＡ檢測(cè)方法》和《禽流感病毒ＮＡＳＢＡ檢測(cè)方

法》。

３．５　環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和不斷對(duì)傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增技術(shù)的改進(jìn)，Ｎｏｔｏｍｉ等（２０００）首先報(bào)道了一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，

即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?。椋螅铮簦瑁澹颍恚幔臁。幔恚穑欤椋妫椋悖幔簦椋铮?，ＬＡＭＰ）。該技術(shù)利用兩對(duì)特殊引物和有鏈置換活性的Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶，使反應(yīng)中在模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，在等溫條

件下使引物順利與模板結(jié)合并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。謝青梅等（２０１０）根據(jù)ＨＡ基因保守區(qū)的序列，設(shè)計(jì)４條特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物加入核酸染色劑ＳＹＢＲ?。牵颍澹澹睥窈停矗恚恚铮欤獭。停纾玻?，結(jié)果可視。擴(kuò)增產(chǎn)物可用特異性內(nèi)切酶ＫｐｎⅠ進(jìn)行酶切鑒定。用已建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技術(shù)檢測(cè)臨床樣品，檢測(cè)結(jié)果與ＲＴ－ＰＣＲ方法一致。ＲＴＬＡＭＰ技術(shù)整個(gè)檢測(cè)過程只需１～２ｈ，不需要ＰＣＲ儀和成像系統(tǒng)，僅需要恒溫水浴鍋即可完成試驗(yàn)。通過特異性、敏感性試驗(yàn)，驗(yàn)證了建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技術(shù)可以作為一種操作簡(jiǎn)單，靈敏性、特異性高的檢測(cè)Ｈ５亞型禽流感病毒的方法。

３．６　核酸探針技術(shù)　
核酸探針技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究應(yīng)用zui廣泛的技術(shù)之一，是定性和定量檢測(cè)特異性ＤＮＡ或ＲＮＡ的有力工具。

黃庚明等（２００１）利用ＰＣＲ技術(shù)建立并優(yōu)化了檢測(cè)ＡＩＶ核蛋白片段（ＮＰＣ）的地高辛標(biāo)記的ｃＤＮＡ探針雜交法。該探針有較好的特異性和敏感性，為從分子水平探討ＡＩ的發(fā)病機(jī)理和臨床早期快速診斷提供了新的研究手段。

４結(jié)語

目前，禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷主要從兩方面著手：①針對(duì)病原進(jìn)行診斷；②針對(duì)病原產(chǎn)生的特異性抗體進(jìn)行診斷。由于病原的特異性抗體產(chǎn)生時(shí)間較長(zhǎng)，有時(shí)急性病例的家禽在瀕死前還檢測(cè)不到其特異性抗體。隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)及其不斷改進(jìn)，這種針對(duì)病原核酸的診斷方法具有更為準(zhǔn)確、靈敏、特異的特點(diǎn)，*可用于早期快速診斷目的，并具有其自身*的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。

現(xiàn)代試驗(yàn)診斷技術(shù)向兩個(gè)方向發(fā)展：①配備有高性能技術(shù)設(shè)備的中央檢驗(yàn)，②無需特殊技術(shù)和儀器的現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)（ｐｏｉｎｔ?。铮妗。悖幔颍濉。簦澹螅?，ＰＯＣＴ）（楊繼瓊，２００８）。無疑對(duì)ＡＩＶ的初步篩選和鑒定可用ＰＯＣＴ方法，比如ＡＩＶ的膠體金診斷試紙條進(jìn)行，這部分工作可在養(yǎng)殖場(chǎng)或疫情暴發(fā)地進(jìn)行，而對(duì)于ＡＩＶ重大疫情的確診則要依靠技術(shù)設(shè)備先進(jìn)的中

央檢驗(yàn)來完成。隨著公眾對(duì)ＡＩＶ防制意識(shí)的加強(qiáng)和試驗(yàn)診斷及疫苗研制技術(shù)的發(fā)展，對(duì)ＡＩＶ的早期診斷和及時(shí)治療是有可能實(shí)現(xiàn)的。

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禽流感病毒檢測(cè)技術(shù)的研究新進(jìn)展

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