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| 摘要： 來自斯坦福大學的Michael Z Lin，與加州大學圣地亞哥分校的錢永健等人發(fā)表了題為“Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins”的文章，獲得熒光蛋白研究的重要突破——設(shè)計了兩個熒光蛋白，Clover 和mRuby2,，這兩種蛋白具有迄今為止zui明亮的熒光性和RFP特性。相關(guān)成果公布在Nature Methods雜志上。 找 |
來自斯坦福大學的Michael Z Lin，與加州大學圣地亞哥分校的錢永健等人發(fā)表了題為“Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins”的文章，獲得熒光蛋白研究的重要突破——設(shè)計了兩個熒光蛋白，Clover 和mRuby2,，這兩種蛋白具有迄今為止zui明亮的熒光性和RFP特性。相關(guān)成果公布在Nature Methods雜志上。
華裔科學家錢永健曾與另外兩位科學家，由于在發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白GFP方面做出的貢獻而獲得了諾貝爾化學獎。Michael Z Lin在博士后期間曾在錢永健實驗室學習工作，這兩師徒對于熒光蛋白都有著濃厚的興趣。
熒光蛋白之間的能量共振轉(zhuǎn)移FRET被廣泛用于監(jiān)測活細胞的生化過程，大部分以FRET為基礎(chǔ)的報告系統(tǒng)都采用的是CFPS和YFPs作為熒光基團。然而，這兩者在FRET上都存在問題，不少CFP-YFP報告系統(tǒng)會出現(xiàn)FRET低動力范圍，CFP的激發(fā)光合復(fù)雜光動能事件，比如可逆光漂白和光電轉(zhuǎn)換，還會帶來光毒性。
而且許多CFP和YFP為基礎(chǔ)的FRET報告系統(tǒng)會出現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的微小變化，因此當生化反應(yīng)很微小，或或短暫的時候，就會造成檢測的困難。如果能開發(fā)出新型的熒光蛋白，就能克服CFPs和YFPs中出現(xiàn)的問題。
在這篇文章中，研究人員設(shè)計了兩個熒光蛋白，Clover 和mRuby2,，這兩者分別具有目前為止zui明亮的綠色和紅色，并且具有此前沒有達到的，zui高的Förster臨界半徑（Förster radius）——是指每一對FRET間50%能量轉(zhuǎn)移時的距離。
研究人員從Aequorea victoria GFP和RFP mRuby20入手，構(gòu)建了zui明亮的熒光蛋白：Clover 和zui明亮RFP特性的mRuby2，這兩者有更大的動態(tài)范圍，以及在現(xiàn)有四種FRET報告基因設(shè)計中的光穩(wěn)定性。
利用改進的報告系統(tǒng)——電壓傳感器，能更可靠的檢測單個動作電位。此外，研究人員采用了改進的RhoA報告系統(tǒng)進行了驗證，研究顯示利用這些系統(tǒng)，在神經(jīng)神經(jīng)生長錐 ephrinA刺激回縮過程中，RhoA的活性能迅速的被檢測到。
在激酶活性報告系統(tǒng)中利用Clover 和mRuby2替換CFP和YFP，小分子GTPase活性和跨膜電壓顯著提高了耐光性，F(xiàn)RET的動態(tài)范圍和發(fā)射率變化，這些改進能提高對短暫生化事件的靈敏性。
除此之外，近期南加州大學一個研究小組利用從水母體內(nèi)分離出的生物熒光蛋白，“看到”了蛋白定向地通過神經(jīng)元以及大腦重建的過程。
上世紀九十年代中期，科學家從水母體內(nèi)分離出綠色熒光蛋白（GFP）。GFP受到藍光照射時，會發(fā)出亮綠色的熒光。用GFP做標記讓人們能看到細胞和神經(jīng)元內(nèi)部的蛋白質(zhì)。但因為神經(jīng)元內(nèi)有許多不同的、互相重疊連接的路徑，至今還無法看到蛋白質(zhì)在神經(jīng)元內(nèi)部的流動。
研究人員開發(fā)出一種新技術(shù)，讓人們進一步看清了蛋白質(zhì)是怎樣定向進入到兩種區(qū)室之一的。他們通過阻塞單條路徑，使浸滿了GFP的運輸泡產(chǎn)生堆積。運輸泡是一種攜帶膜蛋白的小泡泡，能在神經(jīng)細胞內(nèi)上下移動。然后用一種小分子藥物，使這些堆積的發(fā)光運輸泡在一次強光脈沖下突然釋放。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)那些攜帶膜蛋白質(zhì)的運輸泡，應(yīng)該進入樹突的并不是一開始就瞄準了樹突區(qū)室，而是兩種區(qū)室都有進入。但那些進入軸突區(qū)室的很快就停下來，被阻止進一步深入。
原文摘要：
Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins
A variety of genetically encoded reporters use changes in fluorescence （or Förster） resonance energy transfer （FRET） to report on biochemical processes in living cells. The standard genetically encoded FRET pair consists of CFPs and YFPs, but many CFP-YFP reporters suffer from low FRET dynamic range, phototoxicity from the CFP excitation light and complex photokinetic events such as reversible photobleaching and photoconversion. We engineered two fluorescent proteins, Clover and mRuby2, which are the brightest green and red fluorescent proteins to date and have the highest Förster radius of any ratiometric FRET pair yet described. Replacement of CFP and YFP with these two proteins in reporters of kinase activity, small GTPase activity and transmembrane voltage significantly improves photostability, FRET dynamic range and emission ratio changes. These improvements enhance detection of transient biochemical events such as neuronal action-potential firing and RhoA activation in growth cones.
