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實(shí)驗(yàn)步驟
1. 所有容器高溫滅菌兩次，DEPC高溫滅菌，所有的試劑用DEPC配制，高溫滅菌。
2. 在一滅菌2mL管中加入：5mol/L異硫氰酸胍0.7mL、苯酚0.4mL、NaAc(pH4.0) 0.1mL。
3. 稱取0.2g小麥黃化苗的葉片，迅速在液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)入已準(zhǔn)備好的離心管中，劇烈震蕩。
4. 混勻，冰浴30min。
5. 4℃，12000rpm，10min。
6. 上清至另一離心管中加0.4mL氯仿，劇烈震蕩。冰浴放置5min。
7. 4℃，12000rpm，10min。
8. 棄有機(jī)相(下層) 加入0.4mL氯仿和0.4mL酚，室溫放置5min。
9. 4℃，12000rpm，10min，棄有機(jī)相，加入等體積異丙醇。-20℃放置1h。
10. 4℃，12000rpm，10min，沉淀用70%乙醇洗兩次。
11. 室溫稍干燥。
12. 沉淀加20μLDEPC水溶解(-20℃保存)
13. RNA電泳：1％瓊脂糖膠20mL，8μL樣品，1μL樣品緩沖液，1μLSYBR，100V恒壓電泳，測OD260和OD260／OD280。
注意事項(xiàng)
1. 步驟1目的是去除RNA酶(外源)的影響。高溫滅菌兩次可以破壞RNA酶的復(fù)性過程，雖然RNA酶極易復(fù)性，但兩次連續(xù)的高溫會打亂它的復(fù)性歷程，從而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非競爭性抑制劑。DEPC可以與RNA酶的活性中心的組氨酸咪脞環(huán)上的N結(jié)合，從而使RNA酶失活。因?yàn)镈EPC能與RNA的N結(jié)合，從而修飾RNA，所以必須將DEPCzui終除去。在高溫滅菌時(shí)，DEPC因高溫分解而揮發(fā)。UV也能修飾RNA，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)避免。DEPC滅菌后稱為DEPC水，它是不含DEPC的。實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套，必要時(shí)要在超凈工作臺中進(jìn)行。
2. 必須提前準(zhǔn)備好變性劑。異硫氰酸胍可以變性RNA酶，也可以破細(xì)胞。本試驗(yàn)不可以用酶法破細(xì)胞。因?yàn)榈鞍酌窴的適合的條件也可以使RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有機(jī)相(酚相)中，而在堿性條件下，DNA和RNA都在水相中，無法分離。苯酚用于抽提DNA和蛋白質(zhì)。
3. 低溫防止內(nèi)源性RNA酶降解RNA。劇烈震蕩是使所有的細(xì)胞散開，浸在變性劑中。低溫的細(xì)胞在相對高溫的液體中是會形成一團(tuán)，這樣就會使內(nèi)部的RNA沒有水解RNA的機(jī)會。小麥的黃化苗因?yàn)闆]有光合作用，所以含糖少，易于抽提。
4. 步驟6目的是去除脂類。
5. 步驟8目的是去除脂類和蛋白質(zhì)。
6. 步驟9目的是去除糖，脫水，因?yàn)轶w系高鹽(2mol/L NaAc)，所以可以使RNA沉淀。
7. 步驟10注意因?yàn)樘岢龅牧亢苌伲赡懿豢梢?，所以離心要有方向標(biāo)記。
8. RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因?yàn)橛刑嗟奶堑臍堄唷?/p>
9. DEPC水中應(yīng)不含RNA酶。
