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實驗原理
利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片段的克隆菌落。
實驗試劑
1. LB培養(yǎng)基(加抗菌素)
2. PCR用試劑
3. 引物
4. 質(zhì)粒提取用試劑
5. 酶切需要的限制性內(nèi)切酶及其緩沖液，70%甘油(70%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris-HCl pH8.0)。
6. 100mg/ml氨芐青霉素
實驗設(shè)備
1. 旋渦混合器
2. 小鑷子
3. 微量移液取樣器
4. 移液器吸頭
5. 1.5ml 微量離心管
6. 雙面微量離心管架
7. 干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋)
8. 制冰機
9. 恒溫搖床
10. 超凈工作臺
11. 酒精燈
12. 無菌牙簽
13. 搖菌管
實驗步驟
1. 酶切鑒定
1) 在超凈工作臺中取3支無菌搖菌管，各加入3ml LB(含50mg/ml氨芐青霉素)，用記號筆寫好編號。
2) 在超凈工作臺中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過，鑷取一支無菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上的一個白色菌落，然后將牙簽放入盛有3ml LB(含50mg/ml Amp)的搖菌管中。用此法隨機取3個白色菌落，分別裝入3個搖菌管中。
3) 37℃搖菌過后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒。搖菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。
4) 將提取到的3管質(zhì)粒樣品與空質(zhì)粒同時電泳，根據(jù)分子量判斷和選區(qū)有插入片段的質(zhì)粒，然后可用酶切、與目的片段一同電泳來鑒定其上的外源插入片段大小是否與預(yù)期相符。
5) 將經(jīng)過鑒定判斷為正確的質(zhì)粒保存。按照編號找到冰箱中原菌液。根據(jù)需要進行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)?；蜻M行誘導(dǎo)表達，或取500ml菌液與500ml 70%甘油混合后-80℃保存。
6) 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。
2. 快速PCR篩選法
1) 在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機選取3個邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標(biāo)記編號。
2) 在0.2ml PCR 微量離心管中配制25μl反應(yīng)體系。
ddH2O 16μl
10×PCR buffer(不含MgCl2) 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl(每種dNTP終濃度0.2mM)
10μmol/L Primer1 1μl(12.5~25pmoles)
10μmol/L primer2 1μl(12.5~25pmoles)
Taq酶 0.5μl(1.5U)
總體積 25μl
模板質(zhì)粒：用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗。
2) 根據(jù)廠商的操作手冊設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序：
a. 94℃ 5min
b. 94℃ 1min
c. 54℃ 1min
d. 72℃ 1min50s
e. goto b 29 times
f. 72℃ 10min
2) PCR結(jié)束后，取10μl產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(與原始插入片段同時比對)。觀察膠上是否有預(yù)計的主要產(chǎn)物帶。
3) 按照編號找到培養(yǎng)皿中的原菌斑，根據(jù)需要進行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒。
4) 提取到的質(zhì)粒與原先的空載體(或已知分子量的質(zhì)粒)再對比電泳，用酶切以進一步確認。
