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實驗步驟

一、抗原的提取

　　抗原的制備是一件十分細致的工作，要制備一個高純度的抗原，需要付出艱巨的努力，制備工作涉及物理學、化學和生理學等許多領(lǐng)域的知識。根據(jù)物理或化學特性建立起來的分離、純化方法的主要原理不外乎科二個方面：①利用混合物中幾個組分分配率的差別將他們分配到可用機械方法分離的兩或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑抽提、層析和結(jié)晶等；②把混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同的區(qū)域而達到分離的目的，如電泳、超速離心和超濾等。由于組織細胞內(nèi)存著許多分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的抗原物質(zhì)，其分離方法也不一樣，就是同一類大分子物質(zhì)，因選材不同，所使用的方法也很大差別。因此很難有一個通用的標準方法供提取任何生物活性物質(zhì)使用，所以在提取前必須針對所欲提取的物質(zhì)，充分查閱文獻資料，選用合適的方法。如果要提取一個結(jié)構(gòu)及性質(zhì)未知的抗原物質(zhì)，更需要經(jīng)過各種方法的比較探索，才能找到一些工作規(guī)律和獲得預(yù)期的效果。

　　抗原物質(zhì)的制備，大概要經(jīng)過如下過程：①材料的選擇和預(yù)處理；②細胞的粉碎（細胞器的分離）。③提??；④純化；⑤濃縮或干燥，保存?，F(xiàn)分別簡述如下。

　?。ㄒ唬┎牧系倪x擇及預(yù)處理

　　選擇什么材料主要根據(jù)實驗?zāi)康亩?。通常選含量高、工藝簡便、成本低的材料。材料選定后，通常要進行預(yù)處理，剔除結(jié)締組織、脂肪組織等，把組織塊剪碎。若取材后不立即進行提取，則應(yīng)冷凍保存，動物組織更要深低溫保存。某些容易失活的物質(zhì)，一般宜采用新鮮材料。

　　（二）細胞的粉碎

　　除了提取體液、組織間液內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)、酶不需粉碎細胞外，凡要提取組織內(nèi)、細胞膜上及胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)，都必須把組織和細胞粉碎，使活性物質(zhì)充分釋放到溶液內(nèi)。不同的組織，細胞的破碎難易不一，因此所使用的粉碎方法也不*相同。如腦、胰、肝等比較軟嫩的組織，用普通勻漿器研磨就行，肌肉、心臟等則需絞碎后再作勻漿?，F(xiàn)漿常用的細胞粉碎方法介紹如后。

　　1．物理法

　?。?）高速組織搗碎機：通常由調(diào)速器、支架、馬達、帶桿刀葉、有機玻璃筒等組成。把材料放于筒內(nèi)（約占筒內(nèi)容積的1/3）固定筒蓋，開動馬達，調(diào)速器由慢逐漸增至所需速度。此法適用于內(nèi)臟組織。

　?。?）玻璃勻漿器：由一個內(nèi)壁經(jīng)過磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（球面經(jīng)過磨砂）玻璃研桿組成。把絞碎的組織置于管內(nèi)，加適量溶液，插入研桿，用手或電動轉(zhuǎn)動研桿，并上下移動。用此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機高，對大分子的破壞也少。是粉碎少量軟嫩材料（腦、胰、肝等）時常用的方法。

　?。?）超聲波處理法：多用于軟嫩組織，根據(jù)不同組織采用不同頻率，處理10～15min，超聲波處理時溶液溫度升高，使不耐熱的物質(zhì)失活，使用時為防止溫度升高，除間歇開機外，還需人工降溫，避免溶液內(nèi)存在氣泡。核酸及某些酶對超聲波很敏感，要慎用。

　　（4）反復凍融法：把待碎樣品冷卻到零下15～20。C，凍固后取出，緩慢解凍，如此反復操作，可使大部分動物性細胞及胞內(nèi)的顆粒破碎，但也可使生物活性物質(zhì)失活。

　?。?）冷熱交替法：把材料投入90。C左右水中維持數(shù)分鐘后取出投入冰浴內(nèi)，可使大部分細胞破碎。可用于提取蛋白質(zhì)和核酸。

　　2．化學和生物化學法

　　（1）自溶法：把新鮮材料置于一定的pH和適宜的溫度下，利用組織細胞自身的酶系統(tǒng)把組織破壞，使細胞內(nèi)容物釋放出來。動物材料的自溶溫度選在0～4℃，需加少量防腐劑，自溶時間較長，不易控制，不常用。

　?。?）溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌等微生物的細胞壁。在每毫升含2億個細胞的懸液中加100μg至1mg溶菌酶，37℃，保溫10min，細胞就破壞了。此外，蝸牛酶、纖維素酶也被選作破碎細菌細胞之用。

　?。?）表面活性劑處理法：較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。

　　（三）抗原的提取

　　提取、抽提、萃取這3個詞的含義基本相同。但一般說來，提取是指在分離純化前期，將經(jīng)過處理或粉碎了的細胞置于一定條件和溶劑中，讓被提取物充分地釋放出來的過程，而抽提則是貫穿于分離純化的整個過程中，如在制備核酸過程中，用氯仿反復提取蛋白液，用苯酚反復抽提分離DNA和RNA。影響提取的因素主要來自被提取物在提取的溶劑中的溶解度大小以及它由固相擴散到液相的難易。一個物質(zhì)在某一溶劑中的溶解度大小和該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用的溶劑的理化性質(zhì)有關(guān)。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性大分子的等電點遠的pH值使溶解度增加。因此，在不同的抗原提取過程中，所選用的溶劑的性質(zhì)、pH值、離子強度、抽提溫度、介電常數(shù)等因素是提取成敗的重要因素。要達到分離提純的目的，必須靈活地應(yīng)用這些因素。