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實驗原理

ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a)、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

實驗試劑

1.　試劑

　　1)　包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):

　　　　　　Na?CO３　　　　1.59克

　　　　　　NaHCO３　 2.93克

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　2)　洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M

　　　　　　KH₂PO₄ 　　　　　0.2克

　　　　　　Na₂HPO_４·12H₂O　　2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　3)　稀釋液：

　　　　　　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

　　　　　　　加洗滌緩沖液至100ml

　　　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。

　　4)　終止液(2M　H２SO４）：

　　　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。

　　5)　底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):

　　　　0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml

　　　　0.1M 檸檬酸(19.2克／L)　　　　　 24.3ml

　　　　加蒸餾水50ml。

　　6)　TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:

　　　　TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml

　　　　底物緩沖液(PH5.5)　　　 10ml

　　　　0.75％H２O２　　 　32μl

　　7)　ABTS使用液:

　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg

　　　　底物緩沖液(PH5.5)　 1ml

　　　　3％H２O２　 　2μl

　　8)　抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

　　9)　正常人血清和陽性對照血清。

實驗設(shè)備

聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

4℃冰箱，37℃孵育箱。

實驗步驟

方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ "、“-"號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

方法二　用于檢測未知抗體的間接法：

　　　　　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
　　　　　　每孔加0.1ml，4℃過。次日洗滌3次。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔
　　　　　　中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，
　　　　　　37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。

注意事項

1.　正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2.　在ELISA中，進(jìn)行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

　　1)　固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

　　2) 包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。

　　3)　酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

　　4)　酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H₂O₂在臨用前加入。