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免疫組化基礎(chǔ)知識
●免疫組織化學的概念
是應(yīng)用免疫學基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(shù)（immunohistochemistry）或免疫細胞化學技術(shù)（immunocytochemistry）。
●免疫組化的分類
免疫組織化學技術(shù)按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。
其中石蠟切片是制作組織標本zui常用、zui基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復(fù)，是免疫組化中的組織標本制作方法。
免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。
多抗和單抗特性比較：
1.均一性。一種單抗中，每個抗體的化學結(jié)構(gòu)和氨基酸順序都相同，只有一種Ig亞類。即單抗是一種純度很高的均一抗體。而從不同動物，不同時期所得到的多抗，各有不同的化學組成。多抗是多種種類和亞類Ig的混合物。
2.穩(wěn)定性。單抗的穩(wěn)定性較差，對PH變化敏感，對熱不穩(wěn)定，提純過程中易變性，而多抗的穩(wěn)定性則較好。
3.特異性。單抗是單一地針對抗原的某一決定簇，所以用它進行血清學反應(yīng)時，特異性強，敏感性高，一般不發(fā)生交叉反應(yīng)，而多抗能與抗原上的多種抗原決定簇結(jié)合，所以特異性較差，較易引起交叉反應(yīng)。
4.重復(fù)性。單抗的重復(fù)性好，而多抗每批都不一樣。
5.沉淀反應(yīng)。多抗由于與抗原多價結(jié)合容易形成網(wǎng)絡(luò)樣沉淀，而單抗只與抗原結(jié)合產(chǎn)生二聚體，不能直接形成抗原抗體沉淀物。
●免疫組化常用的染色方法
根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法zui常用。
●免疫組化操作步驟
一 免疫組化（ LP 法）操作步驟 ：
1．切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復(fù)，可在此步后進行
2. 緩沖液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。
4. 緩沖液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。
（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩沖液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者zui終決定）
8. 緩沖液洗 5min/2 次。
9. 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增強子 ） , 在室溫下孵育 20 分鐘。
10.緩沖液洗 5min/2 次。
11.滴加 HRP Polymer（ 酶標二抗 ） ，在室溫下孵育 30 分鐘。
（注： HRP Polymer 對光敏感，應(yīng)避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。）
12.緩沖液洗 5min/2 次。
13．向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）
14 ．自來水充分沖洗 , 復(fù)染，脫水 , 透明 , 封片。
二．免疫組化 （ 三步法 ） 操作步驟 ：
（ 1 ）石蠟切片脫蠟至水。
（ 2 ）3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
（ 3 ）蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復(fù)，可在此步后進行）。
（ 4 ）5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。
（ 5 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 6 ）滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 7 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 8 ）滴加適量的 辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 9 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 10 ）顯色劑顯色 3-15 分鐘（ DAB 或 NBT/BCIP ）
（ 11 ）自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。
三. 冰凍切片免疫組化染色步驟：
冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
一 免疫組化（ LP 法）操作步驟 ：
1．切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復(fù)，可在此步后進行
2. 緩沖液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。
4. 緩沖液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。
（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩沖液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者zui終決定）
8. 緩沖液洗 5min/2 次。
9. 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增強子 ） , 在室溫下孵育 20 分鐘。
10.緩沖液洗 5min/2 次。
11.滴加 HRP Polymer（ 酶標二抗 ） ，在室溫下孵育 30 分鐘。
（注： HRP Polymer 對光敏感，應(yīng)避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。）
12.緩沖液洗 5min/2 次。
13．向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）
14 ．自來水充分沖洗 , 復(fù)染，脫水 , 透明 , 封片。
二．免疫組化 （ 三步法 ） 操作步驟 ：
（ 1 ）石蠟切片脫蠟至水。
（ 2 ）3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
（ 3 ）蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復(fù)，可在此步后進行）。
（ 4 ）5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。
（ 5 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 6 ）滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 7 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 8 ）滴加適量的 辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 9 ）PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 10 ）顯色劑顯色 3-15 分鐘（ DAB 或 NBT/BCIP ）
（ 11 ）自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。
三. 冰凍切片免疫組化染色步驟：
冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
從實驗結(jié)果而言，免疫組化技術(shù)服務(wù)主要涉及抗體實驗結(jié)果的描述與分析，圖片的確定與選取，相關(guān)數(shù)據(jù)的提供，上述工作是免疫組化工作的重點內(nèi)容，只有嚴格的實驗設(shè)計，標準的實驗操作，專業(yè)化的結(jié)果分析才能更好的滿足客戶的要求，這點對于形式為腹水，上清，培養(yǎng)液之類的抗體顯得更為重要。關(guān)于上述服務(wù)內(nèi)容應(yīng)該在實驗開始前由雙方明確，一般而言，客戶方實驗前應(yīng)提出需要什么樣的結(jié)果與分析，例如是簡要還是詳細的描述實驗結(jié)果，需要實驗數(shù)據(jù)否，圖片的數(shù)量與規(guī)格等。如果為雙盲試驗或有第三方參與，則事先申明。
●石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？
組織在制作過程中，由于化學試劑的作用封閉了抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發(fā)生扭曲，致使在免疫組化的染色過程中不能將其顯示出來，為了解決上述的問題，利用化學試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露出來或修正過來的過程稱為抗原修復(fù)。
常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是PH6.0的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。
常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是PH6.0的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。
近年來，隨著免疫組織化學技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規(guī)腫瘤病理診斷中，5%-10%的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認可，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時，準確率可達50%-75%。
免疫組織化學的臨床應(yīng)用主要包括以下幾方面：
（1）惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；
（2）確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；
（3）對某類腫瘤進行進一步的病理分型；
（4）軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時難以區(qū)分其組織來源，應(yīng)用多種標志進行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是*的；
（5）發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。
（6）為臨床提供治療方案的選擇。
（5）發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。
（6）為臨床提供治療方案的選擇。
