會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://www.syzwkj.com/st236594/
士鋒生物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟、體系及問(wèn)題分析
點(diǎn)擊次數(shù)：1082 發(fā)布時(shí)間：2014-2-17
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是分子生物學(xué)常用技術(shù)，是體外擴(kuò)增DNA的方法，設(shè)計(jì)生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，基本是進(jìn)了實(shí)驗(yàn)室都必須掌握的技術(shù)。對(duì)于剛?cè)肷镩T的我們簡(jiǎn)單了解其步驟、反應(yīng)體系很有必要。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction ,PCR)步驟
<img alt="聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟、體系及問(wèn)題分析" 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟、體系及問(wèn)題分析"="" border="1" height="520" data-cke-saved-src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120606/1A223OE-0.jpg" src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120606/1A223OE-0.jpg" width="525" style="vertical-align: middle; border: 0px;">
三步：
1 變性：模板DNA加熱變性
2 退火 引物與它的靶序列發(fā)生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成雜交鏈
3 延伸 4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下，DNA合成酶催化以引物為起始點(diǎn)，按5'-3'方向進(jìn)行延伸。
上面三步為一個(gè)循環(huán)，可使拷貝數(shù)到達(dá)2*E-6-2*E-7
PCR 產(chǎn)物一段雙鏈DNA，是由它的末端引物的5’端決定的。
PS：
1.首輪擴(kuò)增，其產(chǎn)物是大小不均一的DNA分子。長(zhǎng)度應(yīng)大于兩引物之間的長(zhǎng)度。
在第二個(gè)循環(huán)中，由于5'固定，其產(chǎn)物長(zhǎng)度就由等于兩引物之間的長(zhǎng)度。所以幾十個(gè)循環(huán)后就會(huì)產(chǎn)生
大量的兩引物之間序列。
引物設(shè)計(jì)：
1，長(zhǎng)度15~30個(gè)核苷酸，zui多到50個(gè)核苷酸左右。
2, 盡量避免嘌呤和嘧啶堆積的現(xiàn)象。(其實(shí)有時(shí)很難避免，不是很重要)。
3,引物內(nèi)部不應(yīng)該形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，如果引物中有酶切位點(diǎn)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)引物二聚體。(一般不是很重要)
PCR的反應(yīng)條件
1，dNTP濃度過(guò)高會(huì)加快反映速度，但同時(shí)還可以增加堿基的錯(cuò)誤摻入率。
2， 引物濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。
3，TaqDNA聚合酶濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，低則合成產(chǎn)物量減少。
TaqDNA聚合酶無(wú)校正功能，摻入錯(cuò)誤率達(dá)2*E-4個(gè)核苷酸，一個(gè)30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯(cuò)誤率。
4， 在90～95度下可使整個(gè)基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使
TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。
5，DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長(zhǎng)度在15～25時(shí)退火溫度
Tm=4(G+c)+(A+T)，一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低;溫度高，不容易退火但特異性高。退火時(shí)間30秒。
6，延伸溫度一般在70～75度這是TaqDNA聚合酶活性zui高(150個(gè)/S)，當(dāng)引物在16個(gè)堿基以下時(shí)可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開(kāi)始合成。一般<1KB時(shí)間1分鐘即可。當(dāng)<1KB時(shí)在較后的循環(huán)中延長(zhǎng)擴(kuò)增時(shí)間。
7循環(huán)次數(shù)25～30次。
無(wú)產(chǎn)物時(shí)對(duì)策：
1，取10ul擴(kuò)增混合液作模板在進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
2，增加TaqDNA聚合酶濃度
3，增加循環(huán)次數(shù)
4，降低退火溫度
5，加靶DNA量
PCR時(shí)常會(huì)遇見(jiàn)電泳沒(méi)有條帶，基因片段擴(kuò)增不出來(lái)，zui主要的原因就是引物設(shè)計(jì)不合理、退火溫度問(wèn)題、DNA中蛋白雜質(zhì)較多、PCR反應(yīng)體系有漏加的物質(zhì)如dNTP等。