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士鋒生物聚丙烯酰胺凝膠（PAGE膠電泳）電泳的方法與銀染方法
點擊次數(shù)：1382 發(fā)布時間：2014-2-13
PAGE膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳）主要是以PAGE為介質(zhì)，根據(jù)DNA分子大小和電荷分離DNA分子。PAGE膠電泳采用銀染法進行顯色。銀染的原理：一、銀離子（一般是AgNO3)和DNA結(jié)合;二、還原劑甲醛把Ag+還原成銀顆粒，zui終DNA呈現(xiàn)為黑褐色。
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的DNA段和DNA序列分析，其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長度僅相差0.1%(即1000bp中的1bp)的核苷酸分子即能分離。
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N'一亞甲雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑)參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠。聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑的濃度及比例決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍見下表.
丙烯酰胺(%) 有效分離范圍(bp) 溴酚蘭* 二甲苯青*
3.5 100～2000 100 460
5.0 80～500 65 260
8.0 60～400 45 160
12.0 40～200 30 70
15.0 25～150 15 60
20.0 10～100 12 45
*表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對數(shù)目(bp)。
一 器材及試劑
1.電泳儀，垂直電泳槽及其附件，玻璃板，常用實驗器材等。
2.玻璃板處理試劑：
(1) KOH/甲醇溶液：5gKOH溶于100ml甲醇中，用于清洗玻璃板。
(2) 95%乙醇
(3) 親和硅烷溶液：95%乙醇 4ml
冰乙酸 20ul
親和硅烷 20ul
(4) 玻璃硅烷：用移液器取適量于短板上，用無塵擦拭紙涂抹均勻。
2.丙烯酰胺溶液45%
丙烯酰胺：43.4克
N，N'一亞甲基雙丙烯酰胺：1.6克
H2O，加至100ml
裝于棕色瓶內(nèi)，4℃可保存二個月。
3.變性劑尿素0.7g/ml：稱取175g溶于125ml左右水中，定容到250ml。
4.過硫酸銨0.1g/ml：稱取過硫酰銨1g加水至10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一個月。
5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和過硫酸銨一起作為交聯(lián)反應(yīng)的催化劑。易吸潮，4℃封閉保存。
6.1XTBE電泳緩沖液
TBE電泳母液(5×)的配制
1)分別稱取54克Tris堿，27.5克硼酸，20ml 0.5mol/EDTA(PH=8.0)
2)將各組分別加入1升燒杯中，用ddH2O定容到1升。
3)在電泳時使用1倍工作液，按1：4與水混合。
4)1倍液是為了增加電泳工作液的電流的電流量。
5)盛于玻璃瓶，在室溫保存。
使用同樣的TBE配制膠和電泳液，因為兩者間微小的差異就會導(dǎo)致DNA扭曲。
7.上樣緩沖液:含有變性劑
8..超純水及滅菌的超純水
二 聚丙烯酰胺凝膠的制備
根據(jù)分離DNA段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠.
1.玻璃板處理：KOH/甲醇溶液或KOH溶液浸泡玻璃板一定時間，用去污劑和清水清洗干凈，zui后用雙蒸水沖洗兩遍。自然晾干。用95%乙醇擦拭長短板。長短板分別用親和硅烷和玻璃硅烷均勻擦拭。5-10分鐘后再用95%乙醇擦拭長短板。
2.固定玻璃板：處理面向上，把兩個封條分別置于兩側(cè)，把梳子置于長板一端的兩封條間。短板處理面向下蓋到長板上，用夾子固定，再用膠帶封閉除放有梳子一端外的其它三邊縫，防止漏膠。把固定好的玻璃板長向傾斜適當(dāng)角度(300)，短向傾斜角度(200-300)
3.配制膠溶液(5%)： 原膠： 8.34ml
尿素： 45ml
5xTBE： 15ml
雙蒸水：6.66ml
TEMED: 30-36ul
ASP： 240ul
注：由于尿素在室溫難溶解，故在配制膠時應(yīng)提前把尿素溶液置于55℃水浴中預(yù)熱，是尿素*溶解。
4.灌膠：把梳子取出，用注射器取大約50ml的膠溶液，緩緩地使膠溶液注入兩板間，等膠溶液快要溢出時，把玻璃板放平，倒插梳子，用夾子夾緊使梳子和玻璃博間沒有縫隙從而防止點樣時串樣，整個過程不要產(chǎn)生氣泡。
5.凝固：灌完膠后，放于室溫讓其自然凝固，觀察膠邊沿出現(xiàn)折射線就表明膠以凝固。凝膠可立即使用，或保存于室溫24小時，4℃48小時。
三 聚丙烯酰胺凝膠電泳
1.固定玻璃板于電泳儀：取掉玻璃板上的夾子，撕掉膠帶，用清水沖洗干凈玻璃板，短板向里固定于電泳儀支架上，即凹口板面向電泳液。
2.預(yù)電泳：取5xTBE200ml稀釋到1000ml制成1xTBE。向電泳儀下端槽內(nèi)倒1xTBE約500ml，向上槽倒1xTBE，使液面高于短板上沿。拔出梳子，并用注射器吸取適量電泳液把點樣孔洗干凈(因為梳子取出后，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則)。
打開變壓器，調(diào)節(jié)電壓為80W，預(yù)電泳30min。
3.電泳:
1)上樣：插入梳子，在預(yù)電泳期間把選擇性擴增產(chǎn)物94℃變性10min后，迅速置于冰上冷卻。向選擇性擴增產(chǎn)物中按2：1的比例加上樣緩沖液并混勻，取5-6ul上樣。
2)調(diào)節(jié)電壓60W，電泳2小時左右。根據(jù)指示劑遷移位置來判定是否終止電泳。電泳完畢，關(guān)掉電泳儀。取下玻璃板，用冰袋冷卻，準備顯色。
聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出>10ng以上量的DNA條帶.要求更高的靈敏度，可用銀染。
四 聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色----銀染
銀染的原理：銀離子和DNA結(jié)合，還原劑甲醛把銀離子還原成銀顆粒，使DNA條帶呈黑褐色而顯現(xiàn)出來。其靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收。
1.固定：固定液 冰醋酸： 150ml(10%)
雙蒸水：1350ml
把經(jīng)冷卻的膠板置于盛有1.5L的塑料盤中，搖床震蕩30min左右。
2.洗膠：把經(jīng)固定的膠板置于盛有1.5L雙蒸水的塑料盤中清洗兩次，每次2-4min。
3.染色： 染色液 硝酸銀： 1.5g(0.1%)
37%甲醇：2.25ml
加雙蒸水至1.5L
把清洗干凈的膠板置于盛有染色液的塑料盤中，搖床震蕩30min左右。
4.洗膠：把經(jīng)固定的膠板置于盛有1.5L雙蒸水的塑料盤中清洗一次，該步驟動作要迅速，約3s。
5.顯色：顯色液 碳酸鈉： 45g(0.03g/ml)
37%甲醛： 2.25ml(0.15%)
硫代硫酸鈉：300ul(10mg/ml)
加雙蒸水至1.5L
把清洗干凈的膠板置于盛有顯色液的塑料盤中顯色。顯色時間根據(jù)條帶和背景顏色深淺調(diào)整，達到DNA條帶清晰的目的。顯色液一定要預(yù)冷至4-10，否則會使被背景加深。
6.終止顯色：把染色完畢的膠板放回盛有固定液的塑料盤中，反應(yīng)3min。用雙蒸水清洗兩次(每次2min)。
7.干膠：膠板置于室溫自然干燥。
8.條帶統(tǒng)計。
注：1.固定時間可以減少，只要指示劑顏色消失即可
2.提高硝酸銀濃度(0.2%)，可減少染色時間。
注意事項：PAGE膠電泳，采用銀染法顯色后，雖然其靈敏度比EB高很多，但是這種方法不利于DNA回收。