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士鋒生物免疫共沉淀原理及試劑配制方法
點(diǎn)擊次數(shù)：920 發(fā)布時(shí)間：2014-1-16
一 原理：
IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。
實(shí)驗(yàn)zui需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說(shuō)明書(shū)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。
其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。
再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。欲速則不達(dá)，確定好比例很必要。
二 準(zhǔn)備：
器械
微量高速冷凍離心機(jī)
移液槍
旋轉(zhuǎn)盤
電泳設(shè)備
vortex震蕩器
液氮及組織粉碎器
試劑
細(xì)胞或組織
蛋白定量kit
SDS電泳試劑
抗體(單抗時(shí)選擇protein G,二抗選擇抗鼠Ig兔血清)
PBS
NaN3
proteinA sapharose
試劑配制
抗原蛋白溶解緩沖液
1.RIPA緩沖液 (zui終濃度)
1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml (150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%TritonX-100 25ml (1%)
10% DOC 50ml (1%)
10%SDS 5ml ( o.1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 395ml
toal 500ml
另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，濃度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)