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士鋒生物單克隆抗體的制備
點(diǎn)擊次數(shù)：994 發(fā)布時(shí)間：2013-12-20
（一）雜交瘤細(xì)胞的大量繁殖 克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細(xì)胞就開始無限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價(jià)往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的100~1 000倍。 利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血清等，可以加速和促進(jìn)腫瘤的生長。 1．材料 （1）經(jīng)高壓滅菌的降植烷。 （2）Balb/c鼠：5~8周齡。 （3）雜交瘤細(xì)胞：取對數(shù)生長期的細(xì)胞。 （4）RPMI—1640培養(yǎng)液 （5）新生牛血清 2．操作方法 (1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周內(nèi)種植細(xì)胞。 (2) 收取對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，用５％FCS—1640液洗滌一次，1 000r/min離心10min。 (3) 取樣，用臺(tái)盼蘭染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107細(xì)胞/ml的懸液。 (4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107個(gè)細(xì)胞/ml）。 (5) 接種后10天左右時(shí)間腫瘤體積zui大，此時(shí)可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下動(dòng)脈或心臟采血后分離。
（二）單克隆抗體的提純 1．材料 (1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液 20 mMol/L NaCl (2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液 40mMol/L NaCl (3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液 80 mMol/L NaCl (4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液 (5) 飽和硫酸銨液 (6) DEAE—纖維素柱 一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg~36mg。 （8）過DEAE—纖維素柱：纖維素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。 樣品進(jìn)入柱床速度為1ml~2ml/min，以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫。 測OD280nm收集蛋白峰，單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細(xì)胞。免疫多次的多為IgG。
（三）單克隆抗體的鑒定 1．雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查 采用秋水仙素裂解法進(jìn)行。 2．單克隆抗體的類型、亞型的測定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，采用瓊脂擴(kuò)散法或elisa夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。 3．單抗的特異性鑒定 可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等，同時(shí)還需做免疫阻斷試驗(yàn)等。 4．單抗的效價(jià)測定 可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價(jià)不同。培養(yǎng)上清液的效價(jià)遠(yuǎn)不如腹水的效價(jià)。采用凝集反應(yīng)，腹水效價(jià)可達(dá)5×104。而采用ELISA檢查，腹水效價(jià)可達(dá)1.0×106。單抗的效價(jià)以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示。5．必要時(shí)還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。