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士鋒生物抗體的制備原理與方法
點擊次數(shù)：1115 發(fā)布時間：2013-12-18
抗體的制備方法與原理
一、抗血清的制備
有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩?，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強和效價高）的抗體。
（一）用于免疫的動物
作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，為///雄性，此外還需十分注意動物的飼養(yǎng)，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。
（二）免疫途徑
免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。
（三）佐劑
由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。
佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強機體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。
常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不*福氏佐劑，在每毫升不*佐劑加入1～20mg卡介苗就成為*佐劑。
配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積*或不*佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)*不擴散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能*乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。
（四）免疫方法
抗原劑量，劑量為300～500μg，加強免疫的劑量約為劑量為1/4左右。每2～3周加強免疫一次。加強免疫時用不*佐劑，免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強免疫時不必注射百日咳疫苗。
在第2次加強免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價（見后）。如未達(dá)到預(yù)期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止（圖2-3）。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。
抗體的制備原理與方法圖2-3 抗體反應(yīng)
（五）抗血清的采集與保存
家兔是zui常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進行。
收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。
（六）抗血清質(zhì)量的評價
在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作*的評價后，才可使用所取得的抗血清。