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士鋒生物常用的標(biāo)記免疫酶及其底物
點(diǎn)擊次數(shù)：975 發(fā)布時(shí)間：2013-12-5
.標(biāo)記酶的選擇條件
⑴ 活性高，分解底物的能力強(qiáng)。
⑵ 特異性強(qiáng)，即作用于底物的專一性強(qiáng)。
⑶ 與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。
⑷ 與底物作用可以顯色。
⑸ 純度高、易純化，即含雜蛋白少。
⑹ 可溶性（水溶性）好，在溶液中穩(wěn)定。
⑺ 測定方法簡單。
⑻ 酶來源方便、價(jià)格低廉。
2.符合條件的酶
⑴ 辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase HRP），分子量40 000。
⑵ 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP），分子量82 000。
⑶ β-半乳糖甙酶（β-galactosidase），分子量540 000。
⑷ 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）,分子量186 000。
其中以HRPzui為常用，因其具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點(diǎn)。
3.辣根過氧化物酶
HRP廣泛地分布于植物界，以辣根中含量zui高。它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉輔基組成的一種糖蛋白，含糖量18%，它由300個(gè)氨基酸和4個(gè)二硫鍵連接而成。分子量40 000，等電點(diǎn)5.5～9.0之間，它催化的zui適pH因供氫體不同而有所差異，但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。
HRP酶蛋白和其它雜蛋白的zui大吸收光譜為275nm，輔基部分的zui大吸收光譜為403nm，二者比值OD403/OD275為酶的純度。以RZ值（Reinheit Zabl德文）表示。RZ>3為高質(zhì)量，RZ>2.5為中等質(zhì)量，RZ<2.5則需要純化。RZ值越小，表示雜蛋白越多,如RZ為0.6，則表示有75%的雜蛋白。
衡量酶質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)有兩條，一個(gè)是純度即RZ值，一個(gè)是活力。只用酶的純度表示是不全面的。目前上規(guī)定,酶的活力以單位表示。一個(gè)酶單位是在一定的條件下（pH、溫度和底物濃度）一分鐘能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的單位數(shù)稱為比活性。用比活性進(jìn)行酶的比較。
用作標(biāo)記的過氧化物酶活性一般要大于250units/mg。
4.HRP的作用底物與供氫體 底物為H2O2，催化時(shí)需供氫體。
⑴ 組化法常用的供氫體是3，3′-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（3.3-diamino-benzidine . DAB）。其反應(yīng)物由于形成的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光學(xué)顯微鏡觀察。這種多聚物能還原和螯合（OSO4）形成具有電子密度的產(chǎn)物，可適用于電子顯微鏡觀察。
⑵ 用于ELISA的供氫體有下列數(shù)種。
表 ELISA的供氫體
| 供 氫 體 | 反應(yīng)顏色 | 波長 | 終止劑 | 終止 顏色 | 測定波長 |
| 聯(lián)大茴香胺（OD） | 桔紅 | 512 | 5Mol/L HCI | 黃 | 400 |
| 鄰苯二胺（OPD） | 黃 | 444 | 2Mol/L H2SO4 | 桔黃 | 492 |
| 鄰苯甲苯胺（OT） | 蘭 | 636 | 2Mol/L H2SO4 | 黃 | 442 |
| 5－氨基水楊酸 | 褐 | 475 | 1Mol/L NaOH | 褐 | 449 |
5.堿性磷酸酶
可從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。它是一種磷酸脂酶,其作用是催化磷酸-脂水解釋放出無機(jī)磷酸而顯色?；蛘咄ㄟ^水解產(chǎn)生的磷酸與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，然后在還原劑作用下生成藍(lán)色的產(chǎn)物進(jìn)行測定。