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士鋒生物溶血空斑試驗(yàn)技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：940 發(fā)布時(shí)間：2013-11-19
一﹑原理
溶血空斑試驗(yàn)是體外檢測(cè)單個(gè)抗體形成細(xì)胞（b淋巴細(xì)胞）的一種方法，即將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫過(guò)的家兔淋巴結(jié)或小鼠脾臟制成細(xì)胞懸液，與一定量的SRBC結(jié)合，于37℃作用下，免疫活性淋巴細(xì)胞能釋放出溶血素，在補(bǔ)體的參與下，使抗體形成細(xì)胞周?chē)腟RBC溶解，從而在每一個(gè)抗體形成細(xì)胞周?chē)?，形成肉眼可?jiàn)的溶血空斑。每個(gè)空斑表示一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑大小表示抗體生成細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多少。由于溶血空斑試驗(yàn)具有特異性高，篩選力強(qiáng)，可直接觀察等優(yōu)點(diǎn)，故可用做判定免疫功能的指標(biāo)，觀察免疫應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)變化，并可進(jìn)行抗體種類(lèi)及亞類(lèi)的研究。
目前有關(guān)溶血空斑試驗(yàn)的具體方法很多，現(xiàn)僅將瓊脂平板溶血空斑試驗(yàn)的操作方法簡(jiǎn)介如下。
二﹑材料與試劑
（一） 材料
平皿（直徑5.5cm ×1.5cm），溫箱（37℃），水浴箱（45℃），離心機(jī)，顯微鏡及白細(xì)胞計(jì)數(shù)器，18g～25g昆明系小鼠等。
（二）試劑
1．SRBC懸液 取無(wú)菌脫纖綿羊血（或阿氏液保存的血液），用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗3次，每次2 000r/min離心5min，zui后取壓積紅細(xì)胞，懸于滅菌pH值7.2 PBS（含Ca2+、Mg2+）中，使成為20%濃度，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.00×109個(gè) /ml。
2. 0.1Mol/ L pH值7.2PBS（含Ca2+、Mg2+）.
3.低層和頂層瓊脂 將抗補(bǔ)體作用小的瓊脂（日本瓊脂粉或旅大水產(chǎn)制品廠(chǎng)的產(chǎn)品）用PBS配成1.4%和0.7%兩種濃度。將0.7%的瓊脂分裝小試管，每管1.5ml備用。
4.DEAE-右旋糖酐 分子量5萬(wàn)，用蒸餾水配成1%濃度備用。
5.補(bǔ)體 采集3只以上豚鼠血清，應(yīng)用時(shí)用PBS稀釋成1︰30濃度（如不加DEAE-右旋糖酐，可采用原補(bǔ)體或做1︰5稀釋?zhuān)?nbsp;
三﹑操作方法
（一）免疫脾細(xì)胞懸液的制備
1．小鼠免疫 每只小鼠經(jīng)尾靜脈或腹腔注入上述SRBC懸液0.2ml。
2．脾細(xì)胞懸液的制備 將免疫后第四天的小鼠拉頸處死，解剖取出脾臟，放入含含Ca2+、Mg2+冷的pH7.2的PBS中漂洗后，去掉結(jié)締組織，加入適量的PBS，用彎頭鑷子擠壓脾細(xì)胞，稍靜置，吸上清液至離心管中，1 500r/min離心5min，棄上清后，定量加入PBS，混勻，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算脾細(xì)胞數(shù)，zui后用PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1.00×107 個(gè)/ml，一般每只鼠脾臟細(xì)胞數(shù)為1×108～1.5×108。
（二） 傾注底層瓊脂
將1.4%瓊脂凝膠加熱融化后，傾注于水平位置的平皿內(nèi)，每皿2ml～3ml，凝固后，置37℃溫箱，平皿反扣，開(kāi)蓋1h后備用。
（三） 頂層瓊脂的制備
將0.7%的瓊脂融化后，置于45℃恒溫水浴箱中，依次加入以下試劑：
⑴ 2.00×109/mlSRBC懸液0.1ml。
⑵ 1%DEAE-右旋糖酐0.05ml。
⑶ 1.00×107/ml脾細(xì)胞懸液0.1ml。迅速混勻后，傾注于已鋪好底層瓊脂的
平皿內(nèi)，使之均勻鋪平凝固后，靜置約15min，放37℃溫育1h～1.5h。
（四） 加補(bǔ)體
從溫箱中取出平皿，每皿加入1︰30稀釋的新鮮豚鼠血清1.5ml（如未加DEAE-右旋糖酐，則加原血清或1︰5稀釋的新鮮血清1.5ml），繼續(xù)放37℃溫箱中溫育30min后取出，觀察溶血空斑。也可在室溫下放置1h，4℃冰箱，翌日觀察結(jié)果。如需保存，可加入用生理鹽水或PBS配制的0.25%戊二醛6ml進(jìn)行固定。
四、結(jié)果判定
觀察時(shí)，將平皿對(duì)著光亮處，用肉眼或放大鏡觀察每個(gè)溶血空斑的溶血狀況，并記錄整個(gè)平皿中的空斑數(shù)，同時(shí)求出每百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞內(nèi)含空斑形成細(xì)胞的平均數(shù)。
五、注意事項(xiàng)
⒈ 對(duì)SRBC的要求 因?yàn)镾RBC既是免疫原，也是靶細(xì)胞和指示細(xì)胞，故要求SRBC應(yīng)新鮮，洗滌不超過(guò)3次，每次2 000r/min離心5min，細(xì)胞變形或脆性增大者均不能使用。阿氏液保存的血液可用兩周。
2．免疫所用SRBC的數(shù)量 尾靜脈注射以2.00×104 個(gè)/0.2ml為宜。腹腔注射為4.00×108 個(gè) /ml，用量小，如低于1.00×107個(gè)/ml注射0.5ml，空斑形成極少；用量過(guò)大，超過(guò)2.50×109個(gè)/ml，多不能形成空斑。
3．采取免疫脾的時(shí)間 無(wú)論是經(jīng)尾靜脈還是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾為宜，過(guò)早或過(guò)晚空斑都形成極少。
4．脾細(xì)胞的活力 為了保證脾細(xì)胞的活力，制備脾細(xì)胞過(guò)程中所用PBS（或Hank’s液），臨用時(shí)方從4℃冰箱中取出，或整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。
5．傾注平板的要求 底層要平，上層要把握好溫度。
6．補(bǔ)體的活力 補(bǔ)體活力的大小，對(duì)溶血空斑的形成關(guān)系很大。如出現(xiàn)抗體或補(bǔ)體的活力低下，將不能形成空斑。所以補(bǔ)體要新鮮，并宜將3只以上豚鼠血清混合。試驗(yàn)中加入Ca2＋、Mg2＋是為了活化補(bǔ)體。DEAE-右旋糖酐是一種多鹽的水溶性物質(zhì)，由于瓊脂的半乳糖鏈上含有抗補(bǔ)體的硫酸酯基團(tuán)，DEAE-右旋糖酐能與它形成不可置換的結(jié)合，而使之沉淀，從而消除瓊脂的抗補(bǔ)體作用。
7．空斑計(jì)數(shù) 要求判讀準(zhǔn)確，避免辨認(rèn)造成的誤差。遇可疑空斑時(shí)，應(yīng)鏡檢，對(duì)肉眼結(jié)果進(jìn)行核對(duì)。