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士鋒生物骨、牙組織模板DNA提取實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化
點(diǎn)擊次數(shù)：992 發(fā)布時(shí)間：2013-11-12
1 主要配制試劑
1）0.5M Na2EDTA PH8.0
2） Proeinase K（20 μg/ul）
3）6M GuSCN 10ml
GuSCN 7.2g
加D·W至10ml
水浴60℃～65℃溶解
4） 二氧化硅懸浮液（Silica susponsion、用前混勻）
Silica 12g加D、W至100l
↓
充分混勻置于100ml量筒內(nèi)室溫沉降24小時(shí)
↓
取上層溶液85ml加D、W至100ml，置于100ml量筒內(nèi)充分混勻室沉降5小時(shí)
↓
取上層溶液85ml加12μl 10M HCL、充分混勻
分裝、高壓滅菌（121℃ 20min）備用。
5） 70%乙醇（-20℃）
6）丙酮（-20℃）
7）Nuclease free H2O
2 主要儀器
旋轉(zhuǎn)混搖器（rotator）
電泳儀
紫外分析儀
調(diào)速搖床（Rocker Platform）
Shimadzu UV-250型紫外分光光度計(jì)
3 操作步驟
3.1 樣本準(zhǔn)備
1）骨：骨高壓滅菌細(xì)沙紙磨去骨表面0.5mm厚層，254nm紫外線照射1小時(shí)以防外源性DNA污染;然后用冷的去離子水、乙醇、各振搖15分鐘，取出干燥。將骨片放入盛有液氮搪瓷碗內(nèi)用小型手電鉆鉆取骨粉備用。
2）牙：254nm紫外線照射1小時(shí)，然后用冷的去離子水、乙醇、各振搖15分鐘，干燥后在液氮中冷凍24小時(shí)。用高壓滅菌的密度白布包裹，榔頭敲擊成細(xì)粉沫備用。
3.2 骨、牙組織DNA分離和純化
1）流程圖
樣本+DNA提取buffer消化
↓
二氧化硅結(jié)合DNA
↓
70%乙醇、丙酮洗滌硅珠
↓
56℃洗提DNA
↓
去除二氧化硅
↓
轉(zhuǎn)移DNA溶液
↓
-20℃保存?zhèn)溆?/span>
2）操作
①取骨粉0.25g（牙粉沫0.1g）置于1.5Eppendorf管，加1.0ml 0.5M Na2EDTA（PH8.0）,25μl proteinase K（20μg/μl）。將Eppendorf管置于旋轉(zhuǎn)混搖器上，室溫混搖24小時(shí)。
②將樣品Eppendorf管置于56℃干熱器上繼續(xù)消化2小時(shí)。
③離心13000rpm，5分鐘。
④取上清液700μl移至另一潔凈1.5ml Eppendorf管中（棄沉渣），加700μl 6M GuSCN,20⑤μl二氧化硅懸浮液置于旋轉(zhuǎn)混搖器上，室溫混搖2小時(shí)。
⑤離心13000rpm，20秒，充上清液保留硅珠。
⑥用-20℃ 70%乙醇洗滌硅珠兩次，每次離心13000rpm,20秒。
⑦用-20℃丙酮洗滌一次，離心13000rpm,20秒。
⑧樣品Eppendorpf管置于56℃干熱器上，15分鐘洗提DNA，每5分鐘振搖一次。
⑨離心13000rpm 2分鐘，將60μl DNA溶液移至0.5ml Eppendorf中，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
3.3 DNA定量
3.3.1 凝膠定量
1）配制1%瓊脂糖凝膠：將2g瓊脂糖加入200ml 1×TBE緩沖液中，煮沸溶化，待冷卻至60℃加入10μlEB，充分混勻。
2）將瓊脂糖溶化液灌入制膠模具，放置30分鐘，使其冷卻固化。
3）小心取出加樣硫，將已制好凝膠放入電永槽，加1×TBE緩沖液使其高出膠面約1cm。
4）將標(biāo)準(zhǔn)含量（30μg/ml、20ng/ml、10ng/ml、50μg/ml）DNA樣品，標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量Marker和可見性DNA參照置于干熱器孵育5分鐘，稍離心。
5）將可見性DNA參照物及用作下量尺度的標(biāo)準(zhǔn)量DNA各10μl及待測DNA樣品按從左向右依次加入膠中，兩側(cè)加標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量Marker。
6）150v電壓電泳30分鐘。
7）紫外分析儀上觀察結(jié)果并照像，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照推算樣本DNA含量。
3.3.2 紫外分光光度計(jì)法
采用Shimadzu UV-250型紫外可見分光光度計(jì)測定DNA濃度，儀器預(yù)熱10分鐘，用1.0ml去離子水校正零點(diǎn)，吸取10μl DNA樣品加990μl去離子水混勻，轉(zhuǎn)入石英比色杯中。在260nm，280nm和320nm處讀出光密度。依據(jù)公式DNA樣品濃度=A260×核酸稀釋倍數(shù)×50‰;提取DNA溶液中蛋白含量=1.55×（A280-A320）-0.76×（A260-A320）進(jìn)行計(jì)算，核酸純度由A260/A280的比率進(jìn)行估計(jì)。
4 注意事項(xiàng)
1.本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)用于自然條件下保存6～60年骨。
2.不同處理保存狀況對(duì)骨組織DNA穩(wěn)定性影響不同（如加堿水煮，火燒等），骨組織DNA骨減少。
3.本技術(shù)采用高壓滅菌細(xì)砂紙磨去骨表面0.5mm厚層，254nm紫外線照射1小時(shí)消除外源性DNA污染。