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士鋒生物質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析
點(diǎn)擊次數(shù)：812 發(fā)布時(shí)間：2013-10-30
相關(guān)基礎(chǔ)知識
限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于體外剪切基因片段的重要工具酶。
上世紀(jì)七十年代，當(dāng)人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。*被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來源于流感嗜血桿菌（Heamophilus influenzae）的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點(diǎn)切開DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。
1）寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象
限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)菌細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞自身的DNA不受影響，因?yàn)檫@種細(xì)胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進(jìn)行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。
2）限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性
按限制酶的亞基組成和切斷核酸情況 的不同，分為三類：
Ⅰ型
Ⅱ型*
Ⅲ型
*類（I型）限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈，其切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如Eco B、Eco K等。
第三類（III型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA段，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。
第二類（II型）限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中zui常用的工具酶之一。
這種酶識別的專一核苷酸順序zui常見的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。這種酶的切割可以有兩種方式：
粘性末端 ;是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。
各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。
平頭末端：
II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV 的識別位置是：
3）同裂酶和同尾酶：
同裂酶：有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，這些有相同切點(diǎn)的酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶）。
同裂酶差別只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如Hpa Ⅱ和MspⅠ的識別順序都是
5’……G| CG G……3’
3’……G GC| G……5’
如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有Hpa Ⅱ能夠切割。
同尾酶：
有時(shí)兩種酶切割序列不*相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶
同尾酶的切割產(chǎn)物可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點(diǎn)將被破壞。
4）限制性核酸內(nèi)切酶的命名法
用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母表示寄主菌的物種名稱，如E.coli 用Eco表示，所以用斜體字。
用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血菌（Heamophilus influenzae）Rd菌株用d，即Hind。
如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，如Hind Ⅰ,Hind Ⅱ，Hind Ⅲ等。
3.酶切反應(yīng)的設(shè)計(jì)一般應(yīng)注意問題:
1）大多數(shù)限制酶貯存在50%甘油溶液中，以避免在-20℃條件下結(jié)冰。當(dāng)zui終反應(yīng)液中甘油濃度大于12%時(shí)，某些限制酶的識別特異性降低，從而抑制酶活性。因此加入反應(yīng)的酶體積不超過反應(yīng)總體積的10%。
2）反應(yīng)混合物中基因組DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的基因組DNA會形成粘性DNA溶液,從而抑制酶的擴(kuò)散，并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的基因組DNA濃度為0.1-0.4μg/μl。同時(shí)RNA應(yīng)該盡量消化去除。
3）當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時(shí)，必須選擇好通用緩沖液，則兩種酶才可同時(shí)切割。
4）酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會不同程度地影響限制酶的活性。
5）反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA，可維持酶的穩(wěn)定性。
4.酶切實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng):
1）反應(yīng)取酶時(shí)應(yīng)使用無菌吸頭，以免污染酶液，同時(shí)應(yīng)盡量縮短酶在溫室的放置時(shí)間。
2）反應(yīng)混合物混勻時(shí)，應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。
3）反應(yīng)前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
4）終止酶反應(yīng)可根據(jù)需要采用不同的方法：
①酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng)，可加入含EDTA的終止液終止反應(yīng)。
②若需進(jìn)一步反應(yīng)（如連接，切割等），可將反應(yīng)管置65℃保溫20-30分鐘，以滅活酶，終止反應(yīng)。
③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
5.酶切實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一般思路:
6.實(shí)驗(yàn)材料與儀器
•質(zhì)粒 pUCm-T-TaSTK
•RNase
用含有10mmol/LTris-HCl、15mmol/L NaCl溶液溶解Rnase到10mg/ml，沸水浴15min，保存到-20℃
•SacI 和 XbaI 核酸內(nèi)切酶（Takara）
•酶解緩沖液（10×M buffer）
•離心機(jī)，水浴鍋
•10ml，50ml微量移液器，無菌的1.5ml EP管
實(shí)驗(yàn)方法和步驟
1）質(zhì)粒中RNA的酶
向30ml質(zhì)粒溶液中加入10mg/ml Rnase 2ml，37℃水浴酶解0.5小時(shí)。
2）質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶
Total ddH2O M Buffer SacI XbaI 質(zhì)粒DNA
20ml 13ml 2ml 1ml 1ml 3ml
置于37℃水浴酶解16小時(shí)。酶解完成后，分別加入10倍的上樣緩沖液,然后各取15ml進(jìn)行電泳分析。