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雙向電泳技術(shù)應(yīng)用過程中的關(guān)鍵步驟

a. 樣品制備 （ 蛋白提取 ）

（1） 細胞培養(yǎng)、處理和收集;

（2） 將細胞在 IEF 裂解緩沖液中溶解;

（3） 將樣品離心以去除不溶的細胞碎片和 DNA ，提取上清， -80 ℃保存。

b. 蛋白質(zhì)定量和上樣

（1） 固相 PH 梯度干膠條 （Immobi-line PH Gradient ， IPG） 水化、等電聚焦;

（2）IPG 的平衡;

（3）SDS-PAGE ;

（4） 蛋白質(zhì)檢測：考馬斯亮蘭染色或銀染色。

c. 圖像分析及數(shù)據(jù)處理

將染色后的凝膠放在 GS-710 光密度掃描儀上，掃描后的圖像用 PDQUEST 2D 軟件分析，選擇部分匹配的蛋白質(zhì)斑點進行比較。

2. IPG 的優(yōu)點

a.PH 梯度穩(wěn)定、聚焦準(zhǔn)確、精度高;

b. 無陰極漂移、堿性蛋白丟失的現(xiàn)象;

c. 蛋白上樣量大，可提高低含量成分的分辨效果;

d. 樣品中的鹽的干擾少，無邊緣效應(yīng);

e.PH 梯度、分離結(jié)果重現(xiàn)性好。

3. 在雙向電泳應(yīng)用中所面臨的問題

許多疏水性蛋白質(zhì) （ 如膜蛋白 ） 不溶于樣品緩沖液，分子量過大 （>200kD （ 千道爾頓 ）） 酸性或堿性蛋白在電泳過程中易丟失， 2DE 不能分辨。低含量組分易被高含量組分遮蔽，降低分辨率。蛋白在提取和消化過程中的丟失、凝膠的污染、在不影響分辨率情況下的上樣量等等。

雙向電泳實驗步驟和溶液配置

A. 實驗過程

一、 實驗原理：2-DE的*向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點和分子量的信息。

二、 實驗步驟：

1. 樣品的溶解

取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液（1mg蛋白:100ul裂解液）振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個小時。其中每隔10～15分鐘振蕩一次，然后13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清分裝，每管70ul，—80oC保存。

2. Bradford法測蛋白含量

取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白含量。

取7個10ml的離心管，首先在5個離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液，再在每管中加入相應(yīng)體積的雙蒸水（總體積為80ul），然后，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品OD值。（測量過程要在一個小時內(nèi)完成）。例如：

編號 蛋白量（ul） Buffer（ul） Bradford（ml） OD595值

1 0 80 4 0

2 5 75 4 0.024

3 10 70 4 0.061

4 15 65 4 0.091

5 20 60 4 0.116

Bt4 2 78 4 0.079

Bt4 4 76 4

轉(zhuǎn)Bt4 2 78 4 0.075

轉(zhuǎn)Bt4 4 76 4

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式：Y= aX+b.其中Y為 OD值，X為蛋白含量。 a、b通過作圖輸入數(shù)據(jù)可知

相關(guān)系數(shù)通過輸入數(shù)據(jù)，作圖，軟件分析可得

OD值測量過程：

比色皿用70%的乙醇保存，待用時用雙蒸水沖洗，再用無水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測樣品溶液潤洗，然后，加入樣品，測定OD值。

3. 雙向電泳*向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水）

3.1 水化液的制備

稱取2.0mg 的DTT，用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer （pH 3-10）振蕩混勻，13200rpm離心15min 除雜質(zhì)，取上清。

在含300ug 蛋白（經(jīng)驗值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul， 振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清。

3.2 點樣，上膠

分兩次吸取樣品，每次170ul, 按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側(cè)，再用鑷子撥開Immobiline DryStrip gels （18cm，pH 3—10）膠條，從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品。注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘;加樣時，正極要多加樣，以防氣泡的產(chǎn)生;壓膠時不能產(chǎn)生氣泡;酸性端對應(yīng)正極，堿性端對應(yīng)負極;樣品加好后，加同樣多的覆蓋油（Bio-Rad），兩個上樣槽必須與底線齊平。

3.3 IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定（跑膠溫度為20oC）

S1 （30v, 12hr, 360vhs, step）

S2 （500v, 1hr, 500vhs, step）

S3 （1000v, 1hr, 1000vhs, step）

S4 （8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad）

S5 （8000v, 5hr, 40000vhs, step） 共計44110vhs, 19.5小時

其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦

3.4 平衡

用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后，在濾紙上吸干（膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為18cm的膠條要將兩頭剪去），再以超純水沖洗，濾紙吸干（再次沖洗過程也可省略），然后用鑷子夾住膠條以正（即酸性端）向下，負（即堿性端）向上，放入用來平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端，酸性端留有溴酚蘭作為標(biāo)記），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。 注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。

平衡第二次時，在沸水中煮Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片，長度與一向膠條的寬度等同，然后吸取煮好的Marker，轉(zhuǎn)入SDS—PAGE膠面上，保持緊密貼合;同樣在第二次平衡時，煮5%的瓊脂糖10ml。

4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE

4.1 配膠（兩根膠條所用劑量）

分離膠：（T=8% 80 ml）：溶液于真空機中抽氣后再加APS和TEMED

30 % 丙烯酰胺儲液 21.28ml

分離膠buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul

雙蒸水 38.72ml

濃縮膠：（T=4.8% 10ml）

30 % 丙烯酰胺儲液 1.6ml

濃縮膠buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul

雙蒸水 5.9ml

4.2 灌膠

將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后（這時會出現(xiàn)三條線）,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保險膜封好。

4.3 轉(zhuǎn)移

剪兩個小的濾紙片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE膠面的一端。然后，將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面上（瓊脂糖凝膠在轉(zhuǎn)移*幾分鐘的時候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態(tài),至用之前再拿出來）,再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠面,其中不斷補加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產(chǎn)生氣泡。

4.4 跑膠

濃縮膠 13mA 分離膠 20mA 共約5.5個小時

5. 銀染（兩根膠條所用劑量）（銀染特別注意用超純水）

5.1 固定 30min 無水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超純水定容至500ml

5.2 敏化 30min 無水乙醇 150ml

Na2S2O3•5H2O 1.5688g

無水乙酸鈉 34g

先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,zui后定容至500ml

5.3 洗滌 5min × 3次

5.4 銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純水定容至500ml

5.5 洗滌 1min × 2次

5.6 顯影 無水Na2CO3 12.5g 用超純水定容至500ml

甲醛（37%）0.1ml, 臨時加

5.7 終止 10min EDTA—Na2•2H2O 7.3g 用超純水定容至500ml

5.8 洗滌 5min × 3次

注：整個雙向電泳實驗中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。

B. 實驗相關(guān)試劑配制

1. Bradford 工作液

95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考馬斯亮蘭G250，溶解完后再加磷

85%磷酸 52ml 酸，zui后超純水定容至500ml。過濾后置于棕色瓶

考馬斯亮蘭G250 0.035g 外加油皮紙保存（Bradford不穩(wěn)定，一周內(nèi)有效）

2. 裂解液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

DTT 60 mM

Tris—base 40 mM（如果有條件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）

3. 水化液儲液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

Tris—base 40 mM

4. 分離膠buffer （pH8.8） 250ml

SDS 0.4% 1g

Tris—HCl 1.5M 45.4275g

5. 濃縮膠buffer （pH6.8） 100ml

SDS 0.4% 0.4g

Tris—HCl 0.5M 6.07g

6. 凝膠儲存液（30%的丙烯酰胺） 250ml

Acr 29.2% 73g

Bis 0.8% 2g

7. 電極緩沖液（跑一次要配制2500ml）

甘氨酸 43.2g 36g

Tris 9g 或 7.5g

SDS 3g 2.5g

超純水定容至3000ml 超純水定容至2500ml

8. 0.5M Tris —HCl pH 6.8儲液

6.1g Tris先用30ml超純水溶解，再用46ml，3M HCl調(diào)pH6.8,再加水定容至100ml

9. 平衡液儲液

脲（即尿素） 36g

甘油 30% 30ml

SDS 1% 1g

0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超純水定容至100ml

10. 平衡液A（一根膠條）

DTT 20mg

平衡液儲液 10ml

11.平衡液B（一根膠條）

碘乙酰氨 300mg

平衡液儲液 10ml

0.05%溴酚蘭 15ul （平衡液A、B均需臨時配制）

12.0.5%瓊脂糖10ml

瓊脂糖 0.05g

電極緩沖液 10ml

溴酚蘭 25ul

補：4、5、6的溶液需過濾后儲存于4OC備用。

C. 藥品

CHAPS 兼性離子去垢劑 去垢劑可破壞蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用，

SDS 離子型去垢劑 提高蛋白質(zhì)的溶解性，防止在等電聚焦時析出

尿素 離液劑 可改變或破壞氫鍵等次級鍵的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)

硫脲 離液劑 變性并使蛋白失活。尿素和硫脲聯(lián)合使用，可

以大大增加蛋白質(zhì)的溶解性

DTT 還原劑 斷裂蛋白質(zhì)分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性。但過分提高DTT的濃度，由于它pKa在8左右，因而會影響pH梯度。DTT在堿性pH下會去質(zhì)子化，等電聚焦時會損耗，導(dǎo)致二硫鍵復(fù)原，蛋白質(zhì)沉淀

BSA Bradford中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用

無水乙醇 和磷酸一起，提供Bradford中的環(huán)境

磷酸 提供Bradford中的酸性環(huán)境

Tris 構(gòu)成緩沖液的成分，可用于抗衡pH的變化

IPG buffer

覆蓋液 即礦物油，防止水分蒸發(fā)，樣品干燥。

丙烯酰胺（Acr） 以丙烯酰胺為單體，甲叉二丙烯酰胺為交聯(lián)劑，

甲叉二丙烯酰胺 （Bis） 在催化劑（Aps）和引發(fā)劑（TEMED）作用下，聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

瓊脂糖

溴酚蘭 指示劑作用

碘乙酰氨（IAA） 平衡液B中使用，中和A液中的DTT

正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小，用于凝膠制作過程中的壓膠

甘油 無機鹽的良好溶劑，熱穩(wěn)定性好

Marker

考馬斯亮蘭G250（Bradford法用） 考馬斯亮蘭G250有紅、藍兩種不同顏色的形式在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當(dāng)與蛋白結(jié)合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定，反應(yīng)化合物在465~595nm處有zui大的光吸收值，化合物顏色 深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系，因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量

甘氨酸 與Tris構(gòu)成緩沖系統(tǒng)

AgNO3

EDTA 金屬螯合劑，可以結(jié)合銀離子，終止銀染過程

2D電泳是表達蛋白質(zhì)組學(xué)的經(jīng)典方法。其重要性可想而知。希望以上資料能夠?qū)Υ蠹业膶嶒炗兴鶐椭?br />