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士鋒生物毛細(xì)管電泳的基本原理
點(diǎn)擊次數(shù)：726 發(fā)布時(shí)間：2013-10-9
毛細(xì)管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種分離、分析技術(shù)，它是凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展，是液相色譜分析的補(bǔ)充。該技術(shù)可分析的成分小至有機(jī)離子、大至生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等。可用于分析多種體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，HPLC分析、快速、微量。
電泳遷移
不同分子所帶電荷性質(zhì)、多少不同，形狀、大小各異。一定電解質(zhì)及PH的緩沖液或其它溶液內(nèi)，受電場(chǎng)作用，樣本中各組分按一定速度遷移，從而形成電泳。
電泳遷移速度（v）可用下式表示：
v=uE
其中E為電場(chǎng)強(qiáng)度（E=V/L，V為電壓，L為毛細(xì)管總長(zhǎng)度）。u為電泳淌度。
電滲遷移
電滲遷移指在電場(chǎng)作用下溶液相對(duì)于帶電管壁移動(dòng)的現(xiàn)象。特殊結(jié)構(gòu)的熔合硅毛細(xì)管管壁通常在水溶液中帶負(fù)電荷，在電壓作用下溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，形成電滲流。帶電微粒在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)際移動(dòng)的速度為電泳流和電滲流的矢量和。
分離分析類(lèi)型
根據(jù)其分離樣本的原理設(shè)計(jì)不同主要分為以下幾種類(lèi)型：①毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）;②毛細(xì)管等速電泳（capillary chromatography，CITP）;③毛細(xì)管膠速電動(dòng)色譜（miceller electrokinetic capillary chromatography，MECC）;④毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gelelectrophoresis，CGE）;⑤毛細(xì)管等電聚焦（capillary isoelectric focusing ，CIEF）。
毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）為HPCE的基本操作模式，一般采用磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液，實(shí)驗(yàn)條件包括緩沖液濃度、pH值、電壓、溫度、改性劑（乙腈、甲醇等），用于對(duì)帶電物質(zhì)（藥物、蛋白質(zhì)、肽類(lèi)等）分離分析，對(duì)于中性物質(zhì)無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離。毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC）為一種基于膠束增溶和電動(dòng)遷移的新型液體色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑作為膠束劑，利用溶質(zhì)分子在水相和膠束相分配的差異進(jìn)行分離，拓寬了CZE的應(yīng)用范圍，適合于中性物質(zhì)的分離，亦可區(qū)別手性化合物，可用于氨基酸、肽類(lèi)、小分子物質(zhì)、手性物質(zhì)、藥物樣品及體液樣品的分析。毛細(xì)管等速電泳（CITP）采用先導(dǎo)電解質(zhì)和后繼電解質(zhì)，構(gòu)成不連續(xù)緩沖體系，基于溶質(zhì)的電泳淌度差異進(jìn)行分離，常用于離子型物質(zhì)（如有機(jī)酸），并因適用較大內(nèi)徑的毛細(xì)管而可用于微制備，但本法空間分辨率較差。毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF）用于具兼性離子的樣品（蛋白質(zhì)、肽類(lèi)），等電點(diǎn)僅差0.001可分離的物質(zhì)。毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）依據(jù)大分子物質(zhì)的分子量大小進(jìn)行分離，主要用于蛋白質(zhì)、核苷酸片段的分離。此外，還有毛細(xì)管電色譜（CEC）及非水毛細(xì)管電泳（CNACE），用于水溶性差的物質(zhì)和水中難進(jìn)行反應(yīng)的分析研究。目前CZE和MECC用得較多，本文以這兩種方法為例來(lái)說(shuō)明HPLC的原理。
CZE的基本原理
HPLC選用的毛細(xì)管一般內(nèi)徑約為50μm（20～200μm），外徑為375μm，有效長(zhǎng)度為50cm（7～100cm）。毛細(xì)管兩端分別浸入兩分開(kāi)的緩沖液中，同時(shí)兩緩沖液中分別插入連有高壓電源的電極，該電壓使得分析樣品沿毛細(xì)管遷移，當(dāng)分離樣品通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行分析處理。HPLC進(jìn)樣一般采用電動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣（低電壓）或流體力學(xué)進(jìn)樣（壓力或抽吸）兩種方式。在毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中，帶電溶質(zhì)在電場(chǎng)作用下發(fā)生定向遷移，其表觀遷移速度是溶質(zhì)遷移速度與溶液電滲流速度的矢量和。所謂電滲是指在高電壓作用下，雙電層中的水合陰離子引起流體整體地朝負(fù)極方向移動(dòng)的現(xiàn)象;電泳是指在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象。溶質(zhì)的遷移速度由其所帶電荷數(shù)和分子量大小決定，另外還受緩沖液的組成、性質(zhì)、pH值等多種因素影響。帶正電荷的組份沿毛細(xì)管壁形成有機(jī)雙層向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的組分被分配至毛細(xì)管近中區(qū)域，在電場(chǎng)作用下向正極移動(dòng)。與此同時(shí)，緩沖液的電滲流向負(fù)極移動(dòng)，其作用超過(guò)電泳，zui終導(dǎo)致帶正電荷、中性電荷、負(fù)電荷的組份依次通過(guò)檢測(cè)器。
MECC的基本原理
MECC是在CZE基礎(chǔ)上使用表面活性劑來(lái)充當(dāng)膠束相，以膠束增溶作為分配原理，溶質(zhì)在水相、膠束相中的分配系數(shù)不同，在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管中溶液的電滲流和膠束的電泳，使膠束和水相有不同的遷移速度，同時(shí)待分離物質(zhì)在水相和膠束相中被多次分配，在電滲流和這種分配過(guò)程的雙重作用下得以分離。MECC是電泳技術(shù)與色譜法的結(jié)合，適合同時(shí)分離分析中性和帶電的樣品分子。