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技術(shù)文章
士鋒生物蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測定和沉淀反應(yīng)
點(diǎn)擊次數(shù)：827 發(fā)布時(shí)間：2013-9-29
一、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定
1、目的：了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì);學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法。
2、原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液酸堿度影響。當(dāng)溶液的PH達(dá)到一定的數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)也不向陽極移動(dòng)，此時(shí)溶液的PH值稱為此種蛋白的等電點(diǎn)。不同的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)各不相同。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。
3、材料與試劑
0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液 200ml（取0.8g酪蛋白，加少量水在乳缽中仔細(xì)研磨，將所得的蛋白質(zhì)懸膠液移入200ml的錐形瓶中，用少量40-50℃的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶內(nèi)。加入10ml1M醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到酪蛋白*溶解為止。將錐形瓶內(nèi)的溶液全部移至200ml的容量瓶內(nèi)，加水至刻度，定容。1.00M醋酸溶液 100ml;0.10M醋酸溶液 100ml;0.01M醋酸溶液
4、儀器
水浴鍋、溫度計(jì)、200ml錐形瓶、100ml容量瓶、吸管（1ml、10ml）、試管、試管架、乳缽
5、操作
（1）取相同規(guī)格的試管4支，按下表順序分別地加入各試劑
1、目的：了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì);學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法。
2、原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液酸堿度影響。當(dāng)溶液的PH達(dá)到一定的數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)也不向陽極移動(dòng)，此時(shí)溶液的PH值稱為此種蛋白的等電點(diǎn)。不同的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)各不相同。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。
3、材料與試劑
0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液 200ml（取0.8g酪蛋白，加少量水在乳缽中仔細(xì)研磨，將所得的蛋白質(zhì)懸膠液移入200ml的錐形瓶中，用少量40-50℃的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶內(nèi)。加入10ml1M醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到酪蛋白*溶解為止。將錐形瓶內(nèi)的溶液全部移至200ml的容量瓶內(nèi)，加水至刻度，定容。1.00M醋酸溶液 100ml;0.10M醋酸溶液 100ml;0.01M醋酸溶液
4、儀器
水浴鍋、溫度計(jì)、200ml錐形瓶、100ml容量瓶、吸管（1ml、10ml）、試管、試管架、乳缽
5、操作
（1）取相同規(guī)格的試管4支，按下表順序分別地加入各試劑
| 試管號(hào) | 蒸餾水（ml） | 0.01M醋酸（ml） | 0.1M醋酸（ml） | 1.0M醋酸（ml） |
| 1 | 8.4 | 0.6 | － | － |
| 2 | 8.7 | － | 0.3 | － |
| 3 | 8.0 | － | 1.0 | － |
| 4 | 7.4 | － | － | 1.6 |
（2）向以上試管中各加入酪蛋白的醋酸鈉溶液1ml，加一管，搖勻一管。此時(shí)1、2、3、4管的PH依次為5.9、5.3、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。zui混濁的一管的PH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。
二、蛋白質(zhì)的沉淀及變性
1、目的：加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí);了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義;了解蛋白質(zhì)扁形與沉淀的關(guān)系。
2、原理：在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電離層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類：（1）可逆的沉淀反應(yīng)：如蛋白質(zhì)的鹽析作用和在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)常用。（蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化）;（2）不可逆沉淀反應(yīng)：如加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固或與重金屬或有機(jī)酸的反應(yīng)（蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變）。蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。
3、材料與試劑
蛋白質(zhì)溶液 500ml（5%卵清蛋白溶液或雞蛋蛋清的水溶液新鮮雞蛋蛋清：水=1：9）PH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液 100ml;3%硝酸銀溶液 10ml;5%三溶液 50ml;95%乙醇 250ml;飽和硫酸銨溶液 250ml;硫酸銨結(jié)晶粉末 1000g;0.1M鹽酸溶液 300ml;0.1M氫氧化鈉溶液 100ml;0.05M碳酸鈉溶液 100ml;0.1M醋酸溶液 100ml;甲基紅溶液 20ml;2%氯化鋇溶液 150ml
4、操作
（1）蛋白質(zhì)的鹽析：無機(jī)鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等兩的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么?將管內(nèi)容物過濾，向管內(nèi)添加硫酸銨粉末到不溶解為止，此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。
（2）重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1-2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清夜，向沉淀中加入少量水，觀察現(xiàn)象解釋原因。
（3）某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)：取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml,再加入1ml5%三溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清夜，向沉淀中加水觀察現(xiàn)象，解釋原因。
（4）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)：取1支試管，加入2ml蛋白質(zhì)溶液，再加入2ml95%乙醇。混勻，觀察現(xiàn)象。加水再觀察解釋原因。
（5）乙醇引起的變性與沉淀：取3支試管，編號(hào)。依下表順序加入試劑：
二、蛋白質(zhì)的沉淀及變性
1、目的：加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí);了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義;了解蛋白質(zhì)扁形與沉淀的關(guān)系。
2、原理：在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電離層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類：（1）可逆的沉淀反應(yīng)：如蛋白質(zhì)的鹽析作用和在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)常用。（蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化）;（2）不可逆沉淀反應(yīng)：如加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固或與重金屬或有機(jī)酸的反應(yīng)（蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變）。蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。
3、材料與試劑
蛋白質(zhì)溶液 500ml（5%卵清蛋白溶液或雞蛋蛋清的水溶液新鮮雞蛋蛋清：水=1：9）PH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液 100ml;3%硝酸銀溶液 10ml;5%三溶液 50ml;95%乙醇 250ml;飽和硫酸銨溶液 250ml;硫酸銨結(jié)晶粉末 1000g;0.1M鹽酸溶液 300ml;0.1M氫氧化鈉溶液 100ml;0.05M碳酸鈉溶液 100ml;0.1M醋酸溶液 100ml;甲基紅溶液 20ml;2%氯化鋇溶液 150ml
4、操作
（1）蛋白質(zhì)的鹽析：無機(jī)鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等兩的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么?將管內(nèi)容物過濾，向管內(nèi)添加硫酸銨粉末到不溶解為止，此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。
（2）重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1-2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清夜，向沉淀中加入少量水，觀察現(xiàn)象解釋原因。
（3）某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)：取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml,再加入1ml5%三溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清夜，向沉淀中加水觀察現(xiàn)象，解釋原因。
（4）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)：取1支試管，加入2ml蛋白質(zhì)溶液，再加入2ml95%乙醇。混勻，觀察現(xiàn)象。加水再觀察解釋原因。
（5）乙醇引起的變性與沉淀：取3支試管，編號(hào)。依下表順序加入試劑：
| 5％卵清蛋白溶液 | 0.1M氫氧化鈉 | 0.1M鹽酸 | 95％乙醇 | PH4.7緩沖溶液 | |
| 1 2 3 | 1 1 1 | － 1 － | － － 1 | 1 1 1 | 1 － － |
振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加入8ml水，然后在第2、3號(hào)管中各加入一滴甲基紅，再分別用0.1M醋酸溶液及0.05M碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化何沉淀的生成。每管再加0.1M鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋原因。