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實(shí)驗(yàn)室中寡核苷酸探針的類型、優(yōu)點(diǎn)
點(diǎn)擊次數(shù)：1031 發(fā)布時(shí)間：2013-9-26
常用的寡核苷酸探針有3種：①特定序列的單一寡核苷酸探針；②較短的簡(jiǎn)并性較高的成套寡核苷酸探針；③較長(zhǎng)而簡(jiǎn)并性較低的成套寡核苷酸探針。多用32P標(biāo)記寡核苷酸探針，如：1）通過T4噬菌體多核苷酸激酶催化的磷酸化反應(yīng)標(biāo)記合成的寡核苷酸探針，在合成寡核苷酸時(shí)期5’端缺少一個(gè)磷酸基，因而易用T4噬菌體多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，而將α-32P從[γ-32P]ATP轉(zhuǎn)移至其5’端。這種磷酸化反應(yīng)zui多能使每一寡核苷酸分子中摻入一個(gè)32P原子。2）用大腸桿菌dna聚合酶i Klenow片段標(biāo)記合成的寡核苷酸探針，其比活性更高，每一寡核苷酸分子可帶有若干個(gè)放射性原子，放射性比活度可高達(dá)2×1010計(jì)數(shù)/（min·mg）。
利用寡核苷酸自動(dòng)合成儀，可很簡(jiǎn)單地合成制備寡核苷酸探針（如15～50bp），寡核苷酸類探針具有以下優(yōu)點(diǎn)：①短的探針比長(zhǎng)探針雜交速度快，特異性強(qiáng)。②可以在短時(shí)間內(nèi)大量制備。③在合成中進(jìn)行標(biāo)記制成探針。④可合成單鏈探針，避免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率。⑤寡核苷酸探針可以檢測(cè)小DNA片段，在嚴(yán)格的雜交條件下，可用于檢測(cè)在序列中單堿基對(duì)的錯(cuò)配。
因此，寡核苷酸探針的研究，對(duì)于提高核酸雜交技術(shù)的特異性和敏感性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍有重要意義。
寡核苷酸探針的非放射性標(biāo)記時(shí)，可用以下幾種方法
1.酶延伸法合成與探針目的基因的3’-端一段互補(bǔ)的寡核苷核序列，此序列的5’-端多加一個(gè)A，與目的基因片段退火，再用Klenow酶延伸，使bio –dUTP摻入探針的3’末端。
2.5’磷酸末端標(biāo)記法帶5’-磷酸的寡核苷酸探針，在咪唑緩沖液中用水溶性碳二亞胺（EDC）處理，可生成活性的磷酸咪唑中間體，與過量的乙二胺作用，就可以引入一個(gè)帶氨基的接臂。用活化生物素標(biāo)記就可以得到5’-磷酸標(biāo)記的寡核苷酸探針。
3.酶標(biāo)探針法用雙功能聯(lián)接劑如辛二酸雙羥基琥珀亞胺酯聯(lián)接寡核苷酸和堿磷酶，可以生成1：1的酶標(biāo)寡核苷酸探針。此法省略了生物素-親合素中間步驟，可減少非特異性反應(yīng)。
4.生物素酰肼胞嘧啶修飾法在亞硫酸鹽催化下，生物素酰肼可置換寡核苷酸探針中胞嘧啶上的氨基而得生物素化寡核苷酸探針。
5.寡核苷酸的酶促加尾標(biāo)記法在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，用非放射性物質(zhì)修飾的核苷酸（生物素dATP；生物素-dUTP；地高辛-dUTP）可加到DNA的3’末端，每個(gè)探針DNA可加上10～20個(gè)修飾堿基。
（1）取-0.5ml硅化塑料離心管，插入冰浴中，加入寡核苷酸（3pmol）×μl，5×加尾緩沖液20μl，5.0mmol/l dUTP 4μl（終濃度200μmol/L），修飾的dNTP（生物素-dUTP；生物素-dATP；地高辛-dUTP）×μl（終濃度100μmol/L），加入至100μl，混勻后加入末端轉(zhuǎn)移酶5u。37℃反應(yīng)1h。
（2）探針純化：乙醇沉淀法：加入50μg tRNA，15ul 4mol/L醋酸鈉和375μl無水乙醇，混勻，-20℃1h，高速離心10min，棄上清，用70%乙醇和無水乙醇再反復(fù)洗沉淀，晾干，再溶于水中，濃度為500ng/ml。
另外，寡核苷酸在引物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中也有著不可忽視的作用，使用合適的寡核苷酸可從三方面考慮：1）估測(cè)即將出現(xiàn)的核酸雙鏈穩(wěn)定性；2）遵從引物選擇通用準(zhǔn)則；3）根據(jù)氨基酸序列design寡核苷酸