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士鋒生物植物體內(nèi)脫落酸、赤霉素的分離和測(cè)定
點(diǎn)擊次數(shù)：750 發(fā)布時(shí)間：2013-9-22
在研究植物生命活動(dòng)過(guò)程中，常常需要準(zhǔn)確了解某一激素的含量以及各激素間的比例。因此，植物內(nèi)源激素的提取分離和測(cè)定是植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中極其重要的內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)以ABA和GA為例，介紹激素的提取、分離及測(cè)定的基本原理和方法。
一、原理 利用脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）能溶解于有機(jī)溶劑（如丙酮、甲醇）的特性進(jìn)行提取，將粗提物經(jīng)過(guò)一系列的分離技術(shù)（如萃取、薄層層析或紙層析等），使ABA、GA與其它成分分離。再對(duì)純化的ABA和GA進(jìn)行生物學(xué)鑒定或物理化學(xué)鑒定。
（一）生物鑒定1.ABA能抑制植物器官的生長(zhǎng)，在一定的濃度條件下，其抑制程度與濃度呈線性關(guān)系。利用這一線性關(guān)系就可確定組織中ABA的含量。2.GA能刺激幼嫩植物的節(jié)間伸長(zhǎng)，特別是矮生植物的莖。在一定濃度范圍內(nèi)，莖的伸長(zhǎng)度與GA濃度呈線性關(guān)系。因此，根據(jù)莖的伸長(zhǎng)度就可確定GA的含量。
（二）物理化學(xué)鑒定：可采用氣相色譜法。
二、材料、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料：植物葉片、水稻種子及幼苗等；
（二）儀器設(shè)備：1.氣相色譜儀；2.分液漏斗；3.組織勻漿器；4.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥器；5.層析缸；6.華特曼-3號(hào)層析紙；7.微量注射器。
（三）試劑：1. 100％甲醇；2. 80％甲醇；3. 石油醚；4. 乙酸乙酯；5. 1mol/LHCl；6. 硅酸GF232；7. 氯仿；8. GA；9. ABA；10. 乙醇；11. 正丁醇；12. 異丙醇；13. 3mol/L氨水。
三、實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果計(jì)算
（一）脫落酸和赤霉素的提取和分離
1.樣品提?。?）取新鮮材料或貯存材料（用100％甲醇固定，放置-10℃冰箱中至待測(cè)時(shí)）10g，剪碎，加入60ml預(yù)冷（＜0℃＝的80％甲醇溶液，勻漿5min，勻漿液在4℃下振蕩（或攪拌）24h，過(guò)濾。殘?jiān)儆?0ml甲醇液振蕩1h。反復(fù)二次，濾液混合。（2）將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥減壓蒸發(fā)（36～38℃）至原體積一半，再加入10ml石油醚提取部分色素，將下層甲醇液取出，棄掉石油醚層，繼續(xù)減質(zhì)濃縮至水溶液。在此水溶液中含有IAA、ABA、GA和CTK等。
2.樣品萃取將水溶液用1mol/LHCl調(diào)pH至2.8～2.5左右。并以與水溶液等體積的乙酸乙酯萃取。將混合溶液裝入分液漏斗，分離水相和乙酸乙酯相。取水相再用乙酸乙酯萃取2次。合并乙酸乙酯溶液。此時(shí)，CTK（細(xì)胞分裂素）存在于水相中，而ABA、GA、IAA存在于乙酸乙酯中。