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士鋒生物SDS-PAGE檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：816 發(fā)布時(shí)間：2013-9-11
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中zui經(jīng)常使用的一種方法。它是將蛋白樣品同離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以及巰基乙醇一起加熱，使蛋白變性，多肽鏈內(nèi)部的和肽鏈之間的二硫鍵被還原，肽鏈被打開(kāi)。打開(kāi)的肽鏈靠疏水作用與SDS結(jié)合而帶負(fù)電荷，電泳時(shí)在電場(chǎng)作用下，肽鏈在凝膠中向正極遷移。不同的大小的肽鏈由于在遷移時(shí)受到的阻力不同，在遷移過(guò)程中逐漸分開(kāi)，其相對(duì)遷移率與分子量的對(duì)數(shù)間成線形關(guān)系。
pGLO是將綠色熒光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖啟動(dòng)子之后的一種表達(dá)載體。攜帶有pGLO的大腸桿菌在含有相應(yīng)誘導(dǎo)物和抗菌素的條件下培養(yǎng)，可以表達(dá)GFP，這比不加誘導(dǎo)物的同樣的大腸桿菌在SDS—PAGE凝膠上要多出一條明顯的條帶。表達(dá)的蛋白也可用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，紫光燈下可以看到誘導(dǎo)后的樣品在凝膠上有綠色熒光條帶出現(xiàn)。還可以通過(guò)免疫印跡染色（Western—blotting）的方法，用GFP的抗體檢測(cè)表達(dá)的外源蛋白。
[儀器、材料和試劑]
（一）儀器
1.垂直板電泳槽及配套的玻璃板，梳子
2.電泳儀
3.干式恒溫培養(yǎng)器
4.微波爐
（二）材料
1. pGLO表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的培養(yǎng)物：用阿拉伯糖誘導(dǎo)的和沒(méi)有加阿拉伯糖誘導(dǎo)的
（三）試劑
1.1.5mo1/L Tris-HCl pH 8.8 （已加SDS ）
2.0.5mo1/L Tris-HCl pH 6.8 （已加SDS）
3.10%SDS
4.30%Acr/Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用雙蒸水定容至100mL，過(guò)濾備用，4℃存放。
5.10%Ap （-20℃存放）
6.2x樣品緩沖液
0.5mo1/L Tris-HCl pH6.8 2mL
甘油 2mL
20%SDS 2mL
0.1%溴酚藍(lán) 0.5mL
2—?—巰基乙醇 l.0mL
雙蒸水 2.5mL
7.5x電極緩沖液
Tris 7.5g
G1y 36 g
SDS 2.5g
雙蒸水溶解，定容至500mL，使用時(shí)稀釋5倍使用
8.染色液：0.2g考馬斯亮藍(lán)R250 + 84mL 95%乙醇 + 20mL冰醋酸，定容至200mL，過(guò)濾備用。
9.脫色液： 酒精：冰醋酸：水=7.5：7.5：85
[實(shí)驗(yàn)步驟]
1.裝配做膠用的玻璃板"三明治"：做1.0mm厚的膠。選擇兩側(cè)的玻璃夾條為1mm的玻璃板，將其夾條面朝上平放在桌面上，把灰色的U形硅膠夾條在上面擺好，然后把帶兩個(gè)“耳朵”的凹玻璃放在上面，使U形硅膠夾條平整、服帖地夾在兩塊玻璃板之間。小心地把這玻璃板“三明治”放到“提籃架子”上，用塑料的“楔子”夾緊，注意底部的U形硅膠夾條在夾緊的過(guò)程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夾縫加滿蒸餾水，檢驗(yàn)是否漏，如果漏水必須重裝。
2.配制濃度為12%的分離膠 （凝膠濃度應(yīng)根據(jù)被分離蛋白的分子量進(jìn)行選擇），配方如下：
雙蒸水 3.3 mL
1.5mo1/L Tris-HCl （pH 8.8） 2.5 mL
Acr/Big（30%） 4.0 mL
10% SDS 100 μL
TEMED 10 μL
10%AP 100 μL
總體積 10 mL （剛好灌制兩塊膠）
混勻后加入兩玻璃夾縫中，并小心在膠面上加入1cm蒸餾水（在膠面上加蒸餾水稱(chēng)水封，目的是保持膠面平整，并防止膠與空氣接觸，影響膠的聚合），室溫放置，等膠自然凝聚后（此時(shí)在膠面與水封之間可見(jiàn)清晰的界限），將水封傾去。這時(shí)可以開(kāi)始配制4%的濃縮膠，配方如下：
雙蒸水 1.8 mL
0.5mo1/L Tris-HCl pH 6.8 0.75mL
Acr/Bis （30%） 0.4 mL
10% SDS 30 μL
TEMED 5μL
10%Ap 30μL
總體積 3.0 mL （夠做兩塊板的濃縮膠）
混勻后加入到"三明治"玻璃板的夾縫中，然后在把1mm的梳子插進(jìn)濃縮膠中，注意在梳子和濃縮膠之間不要留有氣泡。如果發(fā)現(xiàn)有較大的氣泡，一定要想法去掉（可以插拔梳子或指彈氣泡處的玻璃等），否則會(huì)影響電泳結(jié)果。待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子。如果發(fā)現(xiàn)拔出梳子后形成的加樣孔之間的間隔發(fā)生扭曲，用注射器的針頭小心加以整理，使之齊整。
3.細(xì)菌培養(yǎng)物SDS-PAGE樣品的制作：同時(shí)做L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的和未加L-阿拉伯糖的兩個(gè)大腸桿菌樣。取細(xì)菌培養(yǎng)物1.5mL加到1.5mL小離心管中，12000r/m離心3分鐘，去上清。在離心沉淀中加約等體積的蒸餾水，用槍頭小心地吹打，使細(xì)菌充分懸浮，直到?jīng)]有明顯的小團(tuán)塊，然后加入等體積的2×樣品緩沖液，在100℃沸水浴（或干式培養(yǎng)器）中保溫5min。此時(shí)如用槍頭吸取樣品，會(huì)發(fā)現(xiàn)非常粘稠，呈鼻涕狀，這是因?yàn)橛袠悠分泻写罅?/span>DNA的結(jié)果。要用胰島素注射器將樣品從極細(xì)的針頭中打出，反復(fù)多次才能將DNA分子打斷，使樣品變得不再粘稠為止。將樣品14000r/m離心5分鐘，使不溶物沉淀下來(lái)，小心吸取上清加樣。電泳樣品的處理直接關(guān)系到電泳結(jié)果的好壞，一定要認(rèn)真做樣，否則跑不出好膠來(lái)。
4.瓊脂封底：做好膠后，把玻璃板“三明治”從架子中取出，將兩玻璃板之間的硅膠夾條去掉。去掉夾條后在凝膠的底部會(huì)留下一空隙，此空隙要用2%融化的瓊脂填滿，否則在玻璃板浸到電極緩沖液后空隙中的空氣將很難*排除掉，電泳時(shí)會(huì)明顯影響導(dǎo)電，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使整個(gè)電泳失敗。瓊脂封底時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡。
5.電泳槽組裝：封底后將玻璃板“三明治”凹玻璃面向內(nèi)重新裝到“提籃架子”上，固定好后，將整個(gè)部件放到電泳槽的外殼中，然后加電極緩沖液。加液時(shí)要使內(nèi)外槽中的液面基本等高，內(nèi)槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm，以保證能夠?qū)щ姡译妶?chǎng)均勻。
6.加樣：按事先設(shè)計(jì)好的順序與加樣量依次加樣。在樣品的濃度未知的情況下，同一樣品可加一梯度，即每一泳道的加樣量依次減半。這樣，在做第二次電泳時(shí)可以其作為參考，正確加樣。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)可以加在靠中間的加樣孔中，也可加在離邊的第2道處（zui靠邊的一道樣品往往會(huì)明顯跑斜）。
7.電泳：將電泳槽的蓋子蓋上，把電泳槽的兩個(gè)電極接到電泳儀上（注意電極不要接錯(cuò)），然后接通電源。先將電壓調(diào)到80V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，調(diào)節(jié)電壓使恒定在150V。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到離底部約0.5cm時(shí)，關(guān)掉電源，停止電泳。將玻璃板從電泳槽中取出，小心地用舊的卡撬開(kāi)兩玻璃板，暴露出膠面。將濃縮膠部分去掉不要，分離膠放到塑料盒中染色。
8.染色和脫色：凝膠在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色20分鐘（搖床上緩慢振蕩），然后傾去染色液（染色液回收，可反復(fù)用數(shù)十次），用自來(lái)水洗幾下，去掉凝膠上和塑料盒中的染色殘液，加脫色液脫色（搖床上緩慢振蕩），1小時(shí)后換一次脫色液，振蕩脫色。*脫色后的凝膠蛋白條帶清晰，背景透明干凈。這時(shí)可以將凝膠拍照或用掃描儀進(jìn)行掃描，作為*記錄。