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 在下面將列出幾個(gè)影響表達(dá)的因素，大家可以在表達(dá)前根據(jù)這幾個(gè)因素自己分析一下：

1.翻譯起始位點(diǎn)

現(xiàn)在大部分的表達(dá)載體都提供起始位點(diǎn)，所以它已經(jīng)把起始密碼子與核糖體結(jié)合位點(diǎn)的距離進(jìn)行優(yōu)化了，一般情況下不需要自己再加，不過(guò)還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子

2.GC含量

表達(dá)序列中的GC含量超過(guò)70%的時(shí)候可能會(huì)降低蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3.二級(jí)結(jié)構(gòu)

在起始密碼子附近的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不*的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結(jié)構(gòu)上有柄（stem）結(jié)構(gòu)，并且結(jié)合長(zhǎng)度超過(guò)8個(gè)堿基，這種結(jié)構(gòu)會(huì)因?yàn)槲稽c(diǎn)專(zhuān)一突變等因素而變得不穩(wěn)定。

4.基因或者蛋白的大小

一般說(shuō)來(lái)小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達(dá)的。蛋白越小，越容易被降解。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達(dá)，在每個(gè)表達(dá)單位（即單體蛋白）間設(shè)計(jì)蛋白水解或者是化學(xué)斷裂位點(diǎn)。如果蛋白較小，那么加入融合標(biāo)簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進(jìn)融合的蛋白標(biāo)簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達(dá)。

對(duì)于另一個(gè)，大于60kD的蛋白建議使用較小的標(biāo)簽，如6×組氨酸標(biāo)簽。對(duì)于結(jié)構(gòu)研究較清楚的蛋白可以采取截取表達(dá)。當(dāng)然表達(dá)時(shí)要根據(jù)目的進(jìn)行截取，如果是要進(jìn)行抗體制備而截取，那么一定要保證截取的部位抗原性較強(qiáng)。對(duì)于抗原性也可以利用軟件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在線軟件，不過(guò)在分析之余也要認(rèn)識(shí)到這是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的結(jié)論，如果蛋白和免疫動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的話還是不妨一試的。

5.親疏水性

這也是一種經(jīng)驗(yàn)之談，相信經(jīng)常做表達(dá)的人都發(fā)現(xiàn)表達(dá)親水區(qū)域時(shí)表達(dá)量會(huì)比較高，如果你要表達(dá)一個(gè)膜蛋白，那么勸你做好長(zhǎng)期抗戰(zhàn)的準(zhǔn)備吧。有許多軟件可以對(duì)氨基酸的親疏水性進(jìn)行分析，比如Vector NIT Suite，除此之外還可以利用在線跨膜區(qū)預(yù)測(cè)軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 對(duì)跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

對(duì)于自己表達(dá)的蛋白有所了解后就可以開(kāi)始對(duì)載體進(jìn)行選擇了，目前商業(yè)化的載體基本上包含以下幾個(gè)元件：

除了上面標(biāo)出的元件外還需要有復(fù)制起點(diǎn)，它對(duì)于控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)非常重要;另外就是篩選標(biāo)記了，比如藍(lán)白斑篩選的lacZ，各種抗生素標(biāo)記。在以上幾個(gè)元件中，我們需要注意的是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)與啟動(dòng)的元件，也就是調(diào)控子和啟動(dòng)子。其中啟動(dòng)子對(duì)于蛋白表達(dá)的速度起著舉足輕重的作用，它與zui終蛋白的表達(dá)量、是否可融密不可分。這里，對(duì)于世面上廣泛銷(xiāo)售的幾種原核表達(dá)載體使用的啟動(dòng)子進(jìn)行總結(jié)。

乳糖操縱子是應(yīng)用zui廣泛的調(diào)控模式，除了IPTG這種化學(xué)誘導(dǎo)方式之外還有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化學(xué)誘導(dǎo)。如果你害怕這些化學(xué)物質(zhì)會(huì)損害細(xì)菌的生長(zhǎng)，那么你可以嘗試?yán)脺囟日T導(dǎo)的載體，如：pDH2。它利用PL啟動(dòng)子，在溫度上升到42℃后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

可以看到在所有啟動(dòng)子里屬T7啟動(dòng)子zui強(qiáng)，它可以將大腸桿菌的資源zui大程度地調(diào)用過(guò)來(lái)表達(dá)外源蛋白。這樣一些難表達(dá)的蛋白都可以在pET系統(tǒng)里面表達(dá)出來(lái)，但是是不是越強(qiáng)就越好呢?如果你需要表達(dá)蛋白是可溶的，那么T7啟動(dòng)子就不那么適合了。較弱的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄速度較慢，這樣對(duì)于表達(dá)可溶、穩(wěn)定、完整的蛋白比較有利。

Novagen可以說(shuō)是的pET系統(tǒng)是zui的T7啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)，可是當(dāng)T7啟動(dòng)子的強(qiáng)啟動(dòng)效應(yīng)不受歡迎的時(shí)候怎么辦呢?在這里給讀者留個(gè)小小的疑問(wèn)，看看大家有沒(méi)有仔細(xì)看筆者寫(xiě)的Novagen篇。提示一下，雖然它轉(zhuǎn)錄速度快，但是可以控制它的拷貝數(shù)，又或者是……利用這些原理Novagen載體也可以毒性高的外源蛋白。

載體上除了啟動(dòng)子這個(gè)需要注意之外，另外一個(gè)就是標(biāo)簽了。很多標(biāo)簽是為了增加蛋白的可溶性，也有一些是為了方便鑒定表達(dá)產(chǎn)物，所以在表達(dá)時(shí)可以選擇加標(biāo)簽。是否加標(biāo)簽要看個(gè)人需要，筆者認(rèn)為如果是表達(dá)一個(gè)人家沒(méi)表達(dá)過(guò)的蛋白還是加標(biāo)簽，這樣方便將來(lái)鑒定。如果從經(jīng)濟(jì)角度考慮加入6×組氨酸標(biāo)簽，筆者曾經(jīng)以為加什么標(biāo)簽都無(wú)所謂（前提是不需要融合表達(dá)），結(jié)果加了個(gè)Novagen的T7?Tag，等到鑒定的時(shí)候發(fā)現(xiàn)單抗那么貴。而且還不好買(mǎi)的，一些較少人用的標(biāo)簽會(huì)讓你很傷腦筋。這也是表達(dá)前要準(zhǔn)備的功課之一哦。

好了，如果你選好了載體，那么下一步就是設(shè)計(jì)引物的。相信大多數(shù)人都是利用PCR把目的基因調(diào)出來(lái)的吧。設(shè)計(jì)引物可以使用一下兩個(gè)軟件，Primer Premier或者Oligo。如果要表達(dá)全長(zhǎng)，其實(shí)也就沒(méi)那么多要考慮，從一頭一尾找至少8個(gè)匹配序列在加上與載體匹配的序列就可以了。

不過(guò)，我還是有以下幾點(diǎn)提醒一下各位：

1.這一點(diǎn)其實(shí)很容易理解，但是有時(shí)也容易被遺忘。那就是先查查表達(dá)外源片段中含有什么內(nèi)切酶位點(diǎn)，不要設(shè)計(jì)重了，否則酶切時(shí)發(fā)現(xiàn)怎么老是有預(yù)期外的小片段出現(xiàn)。

2.根據(jù)載體上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，現(xiàn)在許多類(lèi)似T載原理的克隆方法也可以應(yīng)用到原核表達(dá)中了，如果T載克隆方法要定向很多時(shí)候要多加4個(gè)堿基，設(shè)計(jì)引物時(shí)候可別忘了加。在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的5’端不要忘了加保護(hù)堿基，不同內(nèi)切酶所需的保護(hù)堿基不同，SalⅠ不需要保護(hù)堿基，EcoRⅤ需要1個(gè)，NotⅠ需要2個(gè)，HindⅢ有3個(gè)。一般情況下，都設(shè)計(jì)2個(gè)。

3.注意啟始密碼子和終止密碼子的讀碼框。如果載體上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，如果中間含有載體序列，務(wù)必確定中間這段序列不會(huì)造成你外源序列的移碼。按情況需要，可以加1到2個(gè)堿基在引物中使讀碼框正確。有始有終，同樣正常的終止密碼子才能保證蛋白的產(chǎn)出。大部分載體也有終止密碼子，如果你對(duì)載體的不放心，也可以在引物中設(shè)計(jì)上終止密碼子，這樣*。

4.還有就是設(shè)計(jì)一對(duì)引物需要注意的地方：一對(duì)引物之間Tm值相差不宜過(guò)大，能一樣;一對(duì)引物不宜形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)、互相配對(duì)，若配對(duì)時(shí)不要是G-C的結(jié)合（可以用軟件分析）;3'端以G、C結(jié)尾為宜等等。如果要詳細(xì)研究可以看一下PCR技術(shù)的相關(guān)書(shū)籍，很厚。還有就是記得把上游引物設(shè)計(jì)成有義鏈，下游設(shè)計(jì)成反義鏈，否則就沒(méi)有片段出現(xiàn)了。雖然這是很小的地方，可是經(jīng)常會(huì)被忽略。

5.如果你是進(jìn)行截取表達(dá)，那么除了之前提到的要注意截取親水區(qū)，還有一點(diǎn)就是對(duì)密碼子的使用頻率進(jìn)行分析。如果在大腸桿菌中使用較少的密碼子在外源片段中連續(xù)出現(xiàn)，還是避開(kāi)它為上策。

看完這么多是不是覺(jué)得有點(diǎn)思緒萬(wàn)千呢。以前給我上課的一位教授說(shuō)過(guò)，做試驗(yàn)，那要大膽設(shè)計(jì)，小心求證?？烊ズ铣梢镩_(kāi)始表達(dá)吧。