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士鋒生物GST融合蛋白的表達與純化介紹
點擊次數(shù)：714 發(fā)布時間：2013-8-30
GST融合蛋白的表達與純化原理
GST 純化系統(tǒng)是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價親和，通過GSH交換洗脫的原理來進行純化 。1ml樹脂大約可結(jié)合5-8 mg融合蛋白，并可反復(fù)使用數(shù)次。試劑u IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，過濾除菌，分裝，-20℃保存。u Lysis buffer （50ml）1）2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2）0.1ml 0.5ml EDTA 3）0.292g NaCl4）0.5ml Triton X-100 5）0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1）0.615g glutathione 2）10 ml 1M Tris，pH8.0 3）90ml distilled water .
GST融合蛋白的表達與純化操作步驟
1）挑一個克隆至2ml LB液中（Amp+ ）
2）37℃振搖至OD600值約為0.6
3）將2ml菌液加入100 ml LB中
4）37℃振搖至OD600值約為0.6
5）加入IPTG至終濃度為1mM
6）繼續(xù)搖3～4h
7）離心（5000 rpm，5min，4℃）
8）用10×柱體積的lysis buffer懸浮細菌
9）超聲破碎細胞
10）離心（12,000rpm,15min,4℃），取上清
11）用濾紙過濾
12）加0.5 ml 50%谷胱甘肽瓊脂糖beads于層析柱
13）5×柱體積的lysis buffer洗層析柱
14）樣品過柱
15）5×柱體積的lysis buffer洗層析柱
16）3×柱體積的elution buffer洗脫蛋白
17）收集蛋白：0.5ml/管 18）取20ml樣品SDS-PAGE鑒定可以在buffer里增加點蛋白酶抑制劑，防止蛋白的降解。