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技術(shù)文章
如何用BCA（二辛可酸）進(jìn)行法蛋白定量
點(diǎn)擊次數(shù)：1113 發(fā)布時(shí)間：2013-8-16
在蛋白質(zhì)定量試驗(yàn)中，zui常用的方法是BCA法蛋白定量。那么為什么我們要選擇用BCA法?因?yàn)锽CA發(fā)蛋白定量具有很多優(yōu)點(diǎn)，如1.實(shí)驗(yàn)操作十分簡(jiǎn)單方便;2.實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短，快速;3.試劑靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確;4.所用的試劑穩(wěn)定性好，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，抗干擾能力強(qiáng)等。
實(shí)驗(yàn)原理：
BCA（bicinchoninic acid）法蛋白濃度定量：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+（biuret reaction）。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nM處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 先將solutionA 搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積solution A加1體積solutionB試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻。BCA工作液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2.稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：*溶解蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（5mg/mlBSA,-20℃保存）取10微升用PBS稀釋至100微升（樣品一般可用PBS稀釋），使終濃度為 0.5mg/ml。
將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品（0.5mg/ml）按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升分別加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20微升。
3.加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液不足道20ul。
即：將蛋白質(zhì)樣品作適當(dāng)稀釋（多做幾個(gè)梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋。
4.在 各孔中加入200微升BCA工作液，這時(shí)使用加樣槍輕柔吹打，將其中液體混勻，這時(shí)請(qǐng)注意，盡量小一點(diǎn)力氣輕柔一點(diǎn)，不要弄出很多氣泡，這樣會(huì)影響讀數(shù)），然后再37℃室內(nèi)放置30-60min。將液體冷卻至室溫，在酶標(biāo)儀上測(cè)定A562nm，或540-590nm之間的波長(zhǎng)的吸光值，zui后可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)的濃度，為樣品蛋白質(zhì)定量。