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士鋒生物蛋白質(zhì)的定量法與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
點(diǎn)擊次數(shù)：860 發(fā)布時(shí)間：2013-8-15
A. Folin-phenol（lowry method）定量法
此法以Biuret方法反應(yīng)為基礎(chǔ)發(fā)展而起，因此會(huì)嚴(yán)重干擾Biuret測(cè)定方法的因子都會(huì)影響此測(cè)定法的準(zhǔn)確度。這些干擾因子包括：含-CS-NH2，-CH2-NH2，-CRH-NH2，-CH2-NH-CHNH2-CH2OH，-CHOH-CH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì)以及緩沖劑如Tris、蔗糖、低濃度的酚類、檸檬酸等，但低濃度的尿素、硫酸胺可以增加碳酸鈉-氫氧化鈉的濃度來校正顯色結(jié)果。1951年Lowry對(duì)于 Folin-Ciocalteu 試劑在不同的 pH值條件下得到此試劑作用的*反應(yīng)條件，此法的靈敏度較Biuret方法高約100倍，反應(yīng)時(shí)間只要約15分鐘即可顯色，顏色的穩(wěn)定度可達(dá)數(shù)小時(shí)，故目前多用Folin-phenol法測(cè)定待測(cè)樣本的蛋白質(zhì)濃度。
原理：蛋白質(zhì)與Folin試劑作用分成兩個(gè)階段：
1.蛋白質(zhì) 先與堿性銅離子作用
Cu2+ + Protein- Cu-Protein
當(dāng)堿性的銅離子試劑和蛋白質(zhì)中的 peptide bond反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生biuret test 的初步呈色反應(yīng)，此蛋白質(zhì)銅復(fù)合物會(huì)再由Phosphomolybdic-phosphotungstic試劑（Folin-Ciocalteu Reagent）作用形成藍(lán)色物質(zhì)。
蛋白質(zhì)分子中可和Folin – Ciocalteu 試劑作用的團(tuán)基有：Histidine的Imidazole Group、Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group、Cysteine的Sulfhdryl Group、Arginine的Guanidino Group。在這些團(tuán)基中，Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Groupzui為重要，堿性蛋白質(zhì)與Folin-Ciocalteu Reagent復(fù)合物的顏色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)中的芳香族官能基 （aromatic group） 成正比。
值得注意的是當(dāng)Folin-Ciocalteu 試劑在強(qiáng)堿的環(huán)境中易使 phosphomolybdate解離而喪失作用的能力，所以此劑須新鮮配制并避免與蛋白質(zhì)中的 Tyrosine 及 Tryptophan 反應(yīng)前置于強(qiáng)堿的環(huán)境中，依比色的方法測(cè)其吸亮度，換算蛋白質(zhì)的量。
* 注意
Folin-Ciocateu phenol 試劑在酸性環(huán)境中才穩(wěn)定，但 Lowry method 必須在 pH=10 才會(huì)發(fā)生，所以 Folin - Ciocalteu Reagent 一加入堿性的硫酸銅-蛋白質(zhì)溶液中（alkaline cooper protein ）必須馬上混合均勻，以確保還原反應(yīng)在phosphomolybdic- phosphotungstate 分解之前發(fā)生。
以上兩種蛋白質(zhì)顯色定量法均會(huì)破壞樣本中的蛋白質(zhì)，故當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣本量少又需要回收時(shí)，不可以使用此種方法定量。
B.紫外線吸收值測(cè)定法
由于蛋白質(zhì)分子中多含有芳香族胺基酸（如苯丙胺酸（phenylalanine）、色胺酸（tryptophan）、酪胺酸（tyrosine） ）殘基，這些殘基含有具共軛電子的苯環(huán)團(tuán)基，故在紫外線波長280nm、260nm會(huì)有吸光值。在波長280nm之吸光值與蛋白質(zhì)的濃度具正相關(guān)性，故可以利用280nm的吸光值做為蛋白質(zhì)的定量工具。此法的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡便，不消耗樣品及不受低濃度的鹽類干擾。但此種測(cè)定方法的缺點(diǎn)是，許多其它物質(zhì)在此波長附近亦有吸光現(xiàn)象，如核酸雖在260nm會(huì)有zui大吸光值，但在280nm處仍會(huì)有吸光的現(xiàn)象。一般而言，純的蛋白質(zhì)之280nm/260nm比值約1.75，但此數(shù)值會(huì)依蛋白質(zhì)含方香族胺基酸含量而變，因此利用此方法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度zui大的缺點(diǎn)是，對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中色胺酸（tryptophan）、酪胺酸（tyrosine）含量差別大的蛋白質(zhì)，測(cè)定的濃度會(huì)有一定的誤差;再者，樣品中如果又含有核酸等吸光物質(zhì)時(shí)亦會(huì)出現(xiàn)大的干擾。因此待測(cè)樣本或標(biāo)準(zhǔn)液在作適當(dāng)?shù)南♂尣⒃诓ㄩL280nm及260nm測(cè)得吸光值后，可以利用下列的公式以校正蛋白質(zhì)的濃度。
公式：
蛋白值濃度（mg/ml） = 1.4280 - 0.7260
Folin-phenol（lowry method）定量法
A. 試劑與儀器：
溶于
1. reagent A：100g NaCO3 1L 0.5N NaOH 。
溶于
2. reagent B： 1g CuSO4?5H2O 100mL ddH2O。
溶于
3. reagent C： 2g NaKC4O6?4H2O 200mL ddH2O。
此三溶液分別儲(chǔ)存。
4. bovine serum albumin solution 300 ug/mL （ W/V）
5. 平口試管13支
6. 試管振蕩器
7. Spectronic 20光電比色計(jì)
8. 安全吸球
9. 玻璃刻度吸管
10. 微量吸管輔助器
B. Lowry method 操作步驟：
1. 將 Spectrophotometer 溫機(jī)。
2. 取 bovine serum albumin solution 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1mL 及未知蛋白質(zhì)樣本 1mL 置于已標(biāo)好的試管中。
3. 在上步驟的試管中加入蒸餾水使試管中的體積為 1mL 。
*此時(shí)取 15mL 的 reagent A 與 0.75mL reagent B 及 0.75mL reagent C 混合均勻成為 reagent D。
4. 取 1mL reagent D 加入步驟 3 之各試管中，馬上以試管振蕩器混合均勻。
5. 將混合液置于室溫 15 分鐘。
*此時(shí)取 5.0mL 2N Folin-phenol reagent 加入 45mL ddH2O，混合均勻。
6. 取 3mL 稀釋的 Folin-phenol reagent 加入步驟 5 之試管中，馬上以試管振蕩器混合均勻。
7. 將混合液置于室溫 45 分鐘。
* 呈色后之產(chǎn)物 45~60 分鐘顏色穩(wěn)定。
8. 在波長 540nm 及 750nm 下分別測(cè)其吸光值。
9. 分別以 A540、A750 濃度 ug/mL 作表、作圖。求得線性回歸方程式，并由方程式求出未知蛋白質(zhì)的濃度。
還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與a-amylase 活性測(cè)定
還原糖的定量測(cè)定與糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：
3,5-dinitrosalicylic acid定量法
利用葡萄糖作為還原糖的單位：
以3,5-dinitrosalicylic acid法堿性的環(huán)境下會(huì)被還原成3-amino-5- nitrosalicylic acid，來檢測(cè)還原糖的存在。
材料與儀器：
1. 3,5-dinitrosalicylic acid （DNSA） 試劑（此藥劑必須新鮮配制）：
配制法：
（1）. 先將Sodium potassium tartrate 300g溶于500ml的蒸餾水中。
（2）. 取 3,5-dinitrosalicylic acid 10g溶于200ml 2M的NaOH溶液中。
（3）. 將（2）之堿性3,5-dinitrosaliylic acid溶液慢慢加入（1）之溶液中。加蒸餾水至 體積1000ml。
2. 1M NaOH
3. 1000mM之glucose。
4. 試管震蕩器
5. 螺旋試管20支
6. 試管架
7. 水浴槽
8. 安全吸球
9. 玻璃刻度吸管
10. 光電比色計(jì)
步驟：
A.
1. 取不同糖試液3ml置于螺旋試管中。（如表一）
2. 加入DNSA試劑1ml，混合均勻。
3. 在95OC水浴中加熱3分鐘。
4. 取出試管冷卻，觀察其顏色變化。
5. 用光電比色計(jì)測(cè)波長540nm下之吸光值。
6. 反應(yīng)之廢液倒入的廢液筒。
表一：依下表配制不同濃度的glucose溶液：
| Tube NO | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Glucose（ml） | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 0 |
| H2O（mL） | 3.9 | 3.8 | 3.6 | 3.4 | 3.2 | 3.0 | 4.0 |
☆ 算出glucose mmole與540nm下吸光值之線性回歸方程式。
a-amylase 活性測(cè)定
材料：
1. 0.1M Na,K-phosphate buffer pH=6.7 （ 0.1M Na2HPO4 與 0.1M KH2PO4 以43.5：6.5（V/V）混合即可。
2. 0.01%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%.、0.5%、1%、2% Glycogen溶于內(nèi)含0.01% NaCl的0.1M Na,K-phosphate buffer中。
3. 2N NaOH（停止反應(yīng)）。
4. 60% Na,K-tartrate。
5. 1% dinitrosalicyclic acid 溶液（DNSA）。
6. 5U/ml a-amylase溶液。
注：
1. 0.5% Glycogen基質(zhì)之配制。
5克Glycogen溶于500ml蒸餾水，攪拌均勻加緩沖液加至體積一升。（Glycogen溶解速度慢需于實(shí)驗(yàn)前配制好）
2. DNSA之配制：
5%之3,5-dinitrosalicyclic acid（溶于2N NaOH）以水作5倍稀釋或以60% Na,K-tartrate溶液作 2：5（V/V）稀釋及即可。
步驟：
1. 取Glycogen基質(zhì)3ml置于 25oC 水浴槽中預(yù)熱3分鐘。（可在室溫操作）。
2. 取出加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μl a-amylase溶液（或是純化步驟中稀釋之收集液）加入各管，混合均勻后置于25oC 水浴槽3分鐘。（酵素液應(yīng)儲(chǔ)放于冰上）
3. 將反應(yīng)液取出加入 1N NaOH 1ml后加以混合以停止酵素反應(yīng)。
4. 待zui后一管完成后，全部之反應(yīng)的試管加入 1ml DNSA，混合均勻。
5. 將試管置95OC 3分鐘，冷卻之至室溫后，在 540nm 讀取吸光值。
☆ 計(jì)算a-amylase之活性單位：
☆ 酵素的活性單位表示法
表二：酵素活性單位（unit of enzyme activity）的表示
| 表示法 | 定義 | 說明 |
| 單位 | 在一定條件下，每一分鐘消耗一定量的受質(zhì)或生成一定量的產(chǎn)物所需的酵素量稱為一個(gè)單位。 | 每分中消耗或生成mmol（10-6mol）；n mol（10-9 mol）；p mol（10-12 mol）的單位分別是mU，nU，pU。 |
| 轉(zhuǎn)變數(shù) （turnover number） | 在一定的條件下，酵素分子每一催化中心的催化產(chǎn)生產(chǎn)物的分子數(shù)即其轉(zhuǎn)變數(shù)。 轉(zhuǎn)變數(shù)=產(chǎn)物的分子數(shù) /酵素分子催化中心的數(shù)目 | a. 轉(zhuǎn)變數(shù)也稱為催化中心活性（catalytic center activity） b.一般一酶分子只有一活化位置，只有少數(shù)例外。所以一般來說：轉(zhuǎn)變數(shù)=催化中心活性。 c.一般酶的轉(zhuǎn)變數(shù)在102~10 |
| 專一活性 （specific activity） | 在一定條件下，每毫克（mg）蛋白質(zhì)所含的酶單位數(shù)稱之。 specific activity = 酶單位數(shù)/mg蛋白質(zhì) | a. 適用于酶的純化過程，可供酶在比較各純化階段的純度之用。 b. 酶的純度愈高其專一活性愈大。 |