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士鋒生物：溶血空斑實驗-抗體產(chǎn)生細胞總數(shù)的檢測
點擊次數(shù)：1637 發(fā)布時間：2013-7-21
取綿羊細胞免疫的小鼠脾臟，制成脾細胞懸液，與一定量的指示細胞（綿羊細胞）和補體結(jié)合，注入自制的小室內(nèi)，經(jīng)37℃孵育后，單個散在的抗體形成釋放抗體，抗體與周圍的綿羊紅細胞（抗原）結(jié)合，并在補體參與下，使綿羊細胞溶解，結(jié)果在抗體形成細胞周圍形成肉眼可見的圓形透明溶血區(qū)——溶血空斑。計算溶血空斑數(shù)目，則可推算脾內(nèi)存在的抗體產(chǎn)生細胞總數(shù)。
材料：
1. 20—22克健康小鼠
2. 解剖器械
3. 注射器，平皿，漏斗，紗布，研缽
4. 20%綿羊紅細胞懸液
5. 潔凈脫脂載玻片（75ⅹ25毫米），蓋玻片（22ⅹ22毫米）。
6. Ph7.2的Hanks液，凡士林油。
7. 微量加樣器
8. 指示細胞懸液，配制方法如下：
10%綿羊紅細胞 0.5毫升
補體（新鮮豚鼠血清）0.5毫升
含5%小牛血清的Hanks液 2毫升 混合后水浴備用
方法：
1.免疫動物
取25%綿羊紅細胞懸液1毫升，無菌操作注入小鼠腹腔中
2.脾細胞液的制備
（1）小鼠免疫4天后，頸椎脫位處死，取脾臟，去除脂肪組織，放平皿內(nèi)，用冷Hanks液洗1—2次。
（2）取出脾臟研缽中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管反復吹打數(shù)次，使細胞分散。將此細胞懸液經(jīng)4—8層紗布過濾，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清。
如細胞太多，可加蒸餾水4毫升迅速混勻，半分鐘后立即加入等量Hanks液混勻1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清。
（3）沉淀細胞用Hanks液洗1—2次，棄上清后，加Hanks液使總量達5毫升。用乳頭吸管吹打使沉淀細胞懸起混勻，此即為50倍稀釋的脾細胞。
（4）取此懸液0.1毫升放另一小試管中然后加0.9毫升Hanks液使成500倍稀釋的脾細胞懸液。
*脾細胞懸液制備過程中應在冰水浴中進行。
3.玻片小室的制作
取潔凈（無油）的載玻片，按下圖粘三條透明膠帶，在膠帶上薄涂一層凡士林（勿涂到小室內(nèi)），然后用鑷子取兩個蓋片，分別放在其上，制成兩個小室。用鑷子尾端將蓋片壓平貼牢（保持小室一定體積）。用凡士林將蓋片底端（其中的任一端）封住，頂端作為注入細胞混合液。
4.細胞混合液的配制
取小試管一只，用1毫升吸管吸取0.2毫升指示細胞懸液，用另一吸管吸取0.2毫升500倍稀釋的脾細胞懸液，混勻即為被檢的細胞混合懸液。
5.混合細胞的灌注
用100ul的微量加樣器吸取被檢細胞混合懸液，于小室開口一端輕輕將液體注滿小室（勿使氣泡產(chǎn)生，勿使液體外溢），記錄實際注入的細胞懸液微升數(shù)（約70ul）
每個樣品注2個小室，取其平均值。
6.用牙簽粘取少許凡士林益封小室開口。
7.將作好的標本水平置濕盒中，放37℃溫箱中孵60分鐘
8.溶血空斑計數(shù)
肉眼觀察空斑并計數(shù)兩個小室出現(xiàn)的溶血空斑數(shù)。對模糊不清的空斑可在低倍鏡下檢查，真正的溶血空斑必須中心有一個淋巴細胞，周圍為透明區(qū)。