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士鋒科技淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體制備方法
點(diǎn)擊次數(shù)：1854 發(fā)布時(shí)間：2013-7-18
制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實(shí)驗(yàn)方法。
一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
（一） 免疫方案
選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開(kāi)始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。
1. 顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip （腹腔內(nèi)注射）
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×10７／0.5ml ip
↓ 3周后
加強(qiáng)免疫（融合前三天） 1×10７／0.5ml ip或iv（靜脈內(nèi)注射）
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏*佐劑，福氏不*佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏*佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏*佐劑皮下多點(diǎn)注射
│ ?。ㄒ话?.8～1ml 0.2ml／點(diǎn)）
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不*佐劑皮下或ip
│ ?。╥p劑量不宜超過(guò)0.5ml）
↓3周后
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip
│ （5～7天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果）
↓2～3周后
加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖鰪?qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性。
（二） 飼養(yǎng)細(xì)胞
在制備單克隆抗體過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長(zhǎng)期保存，隨用隨復(fù)蘇。