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封閉劑在細(xì)胞免疫熒光中的應(yīng)用步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：2468 發(fā)布時(shí)間：2013-4-7
I、步驟：
一、固定：
PBS 5min×3次 振蕩洗滌制作好的細(xì)胞爬片。
固定液覆蓋細(xì)胞，RT 靜置15min。
PBS 5min×3次 振蕩洗滌。
二、通透化：
通透液覆蓋細(xì)胞，RT 靜置30min。
PBS 5min×3次 振蕩洗滌。
三、封閉：
封閉液覆蓋標(biāo)本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：
一抗以合適濃度稀釋PBS，覆蓋標(biāo)本表面。
4℃孵育過夜，第二天37℃復(fù)溫1h。
PBS 5min×3次 振蕩洗滌。
五、二抗孵育：
FITC標(biāo)記二抗以合適濃度稀釋于PBS，覆蓋標(biāo)本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。
六、染核：
新鮮稀釋Hoechst覆蓋細(xì)胞表面，RT避光靜置<10min。
PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。
七、封片：
在干凈的載玻片上滴一滴封片劑，將爬片的細(xì)胞面扣在封片劑上。
八、鏡檢，4℃避光保存。
II、注：
1、細(xì)胞密度要合適，狀態(tài)較好。
2、從孵育二抗開始要避光（關(guān)閉室內(nèi)日光燈即可）。
3、完成后及時(shí)鏡檢，照相;分別用不同波長(zhǎng)激發(fā)熒光，在Photoshop軟件下合成一張圖。
III、試劑配制：
1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：
4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加熱至60℃，持續(xù)攪拌至*溶解，（通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %（v/v）TritonX-100/PBS
3、封閉液：正常山羊血清稀釋于PBS;或商品化封閉液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片劑：50%（v/v）甘油/PBS。