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如何制備畢氏酵母感受態(tài)細胞
點擊次數(shù)：2458 發(fā)布時間：2013-4-6
1、畢氏酵母氯化鋰轉(zhuǎn)化法
（1）試劑
1M LiCl（用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌;必要時用消毒去離子水稀釋）
50% PEG3350（Sigma P3640 用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝）
2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存
注：醋酸鋰對畢氏酵母無效，僅氯化鋰有效;PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用;
（2）感受態(tài)畢氏酵母的制備
接種Pachia pastoris到50ml YPD培養(yǎng)基中，30℃搖菌過夜（約24～28h）培養(yǎng)到OD值為0.8～1.0（約108 Cells/ml）;
收獲細胞，用25ml無菌水洗滌一次，室溫下1500g離心10min;
重懸細胞于1ml 100mM LiCl溶液中，將懸液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管;
離心機zui大速度離心15秒沉淀菌體，重懸菌體于400ul 100mM LiCl溶液中;
按50ul/管分裝，立即進行轉(zhuǎn)化;
注：不要將感受態(tài)酵母菌冰浴;
（3）畢氏酵母的轉(zhuǎn)化
煮沸1ml鮭魚精DNA 5min，迅速冰浴以制備單鏈擔(dān)體DNA;
將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液;
對于每一個轉(zhuǎn)化，按以下順序加入：
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA 25ul
5～10ug/50ul H2O 質(zhì)粒DNA 50ul
劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體*分布均勻（約1min）;
30℃水浴孵育30min;
42℃水浴熱休克20～25min;
6000～8000rpm離心收集酵母菌體;
重懸酵母于1ml YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育;
1～4h后，取25～100ul菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)2～3天鑒定;
2、畢氏酵母PEG1000轉(zhuǎn)化法
（1）試劑
緩沖液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol
緩沖液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35
緩沖液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35
未污染的新鮮、試劑級DMSO，-70℃保存
注：
緩沖液A、B、C均用濾膜過濾，-20℃保存;
將DNA直接加在凍結(jié)的酵母細胞上是本實驗的關(guān)鍵之處（即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降;如進行多樣品的轉(zhuǎn)化，建議按6樣品/組進行）;
（2）待轉(zhuǎn)化畢氏酵母的制備
接種環(huán)接種Pachia pastoris于YPD平板，30℃培養(yǎng)2d;
挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜;
取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.5～0.8;
室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次;
重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷凍，
-70℃保存
（3）畢氏酵母的轉(zhuǎn)化
將約50ug線性化質(zhì)粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于凍結(jié)的酵母細胞中;加入擔(dān)體DNA（40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA）以獲得zui大轉(zhuǎn)化率;
37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次;
取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，*混勻;
30℃水浴孵育1h;
室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中;
離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中;
將所有轉(zhuǎn)化液鋪于選擇性平板，于30℃孵育3～4天后，鑒定;
3、畢氏酵母電轉(zhuǎn)化法
（1）E.coli *0F’感受態(tài)細胞的制備
取10ul *0F’菌液，接種于200ml LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，37℃，200 rpm，16～18小時。取100ul菌液接種于200ml液體LB培養(yǎng)基中。
37℃，200 rpm，培養(yǎng)16～18小時。
滅菌500 ml離心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10%甘油重懸并洗滌。重復(fù)洗滌3次。
第三次離心后，棄絕大部分上清，留下約1ml 液體用于重懸菌體。
從制得得感受態(tài)細胞中，取200ul于滅菌EP管中，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物5ul，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置5min。
將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。
使用電擊穿孔儀進行轉(zhuǎn)化，設(shè)置為電壓 2500 V，時間 5 ms。
電擊后，往電擊杯中加入 800ul SOC培養(yǎng)基，沖洗出菌體，轉(zhuǎn)移至滅菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，輕搖45～60 min。
取全部均勻涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB-Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流動，37℃ 培養(yǎng)12～16小時。
（2）線性化質(zhì)粒DNA對Pichia pastorisGS115的轉(zhuǎn)化
取新鮮制備的（或-70℃凍存的）感受態(tài)細胞置于冰浴中，使其*解凍;
1）將100μl菌體移出至一新的無菌Eppendorf管中，加入5-20μg線性化質(zhì)粒（5～10μl），輕彈混勻，盡數(shù)吸出轉(zhuǎn)移到0.2cm型的電穿孔轉(zhuǎn)化杯中;
2） 轉(zhuǎn)化杯置于冰浴中5～10分鐘，保持低溫。
3） 電穿孔轉(zhuǎn)化電擊條件：電壓：1500V;電阻：400Ω;電容：25μF;脈沖時間：10mS;一次電擊。
4） 電擊后，馬上在電擊轉(zhuǎn)化杯中加入1ml 4℃預(yù)冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液槍吹打均勻，置于冰浴中;
5） 取30℃烘至表面半干的MD培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺上無菌操作涂布平板，400μl/板