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技術(shù)文章
單細(xì)胞凝膠電泳的操作流程與注意事項(xiàng)
點(diǎn)擊次數(shù)：2312 發(fā)布時(shí)間：2013-1-11
單細(xì)胞凝膠電泳（又名彗星實(shí)驗(yàn)）的操作流程主要包括單細(xì)胞懸液的制備、凝膠板制備、細(xì)胞裂解與解旋、電泳與中和、染色和觀察等步驟。本文總結(jié)了單細(xì)胞凝膠電泳操作步驟和注意事項(xiàng)，希望對(duì)初入實(shí)驗(yàn)的同學(xué)有幫助。
1、分離制備單細(xì)胞懸液：
（1）體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化，zui后用PBS懸浮吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞要計(jì)數(shù)，具體的量我前邊已經(jīng)說(shuō)過(guò)。
?。?）體內(nèi)臟器細(xì)胞：處死動(dòng)物，取出臟器，于Hanks’液中制備成單個(gè)細(xì)胞懸液。
2、膠板制備：
（1）取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。蓋玻片推勻，不能有氣泡，4度凝固5至8分鐘。
?。?）水平取下蓋片，取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細(xì)胞懸液（約400個(gè)細(xì)胞）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4度凝固5至8分鐘。
3、細(xì)胞裂解與電泳：
（1）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小時(shí)。
（2）取出膠板，用雙蒸水浸沒(méi)漂洗后放入電泳槽中，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。
?。?）玻片水平放置陽(yáng)附近，4℃電泳20到25分鐘（25V，300mA）。可在電泳槽周圍加冰塊以保持低溫。
4、中和與染色：
?。?）電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中，每次10分鐘，共中和3次，每次要更換中和液。zui后晾干。
?。?）取出膠板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗處染色5到10分鐘。
?。?）蒸餾水漂洗2次，每次5分鐘。
稍晾干，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察。
注意事項(xiàng)：
1.細(xì)胞一定要消化成單個(gè)的，如果你養(yǎng)的細(xì)胞是懸浮生長(zhǎng)的，或者形狀是圓形的（例如hela），那么你可以直接用細(xì)胞刮收細(xì)胞做，否則，如果細(xì)胞是非圓形的，例如成纖維細(xì)胞等，一定要用胰酶消化，使之成圓形，然后才可做實(shí)驗(yàn)。很多做彗星實(shí)驗(yàn)總是出不來(lái)結(jié)果的，可以考慮下是否是這方面的原因。
2.電泳時(shí)，電流與電壓強(qiáng)度在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)要恒定（例如：20V，200mA恒定），這樣出來(lái)的慧尾才有分析價(jià)值，否則你不知道分析因素的差異是由電泳條件的改變引起的還是細(xì)胞處理不同引起的。
3.關(guān)于掉膠的問(wèn)題：蓋玻片兩面都涂上剝離硅烷（挺便宜的一大瓶，但是有毒），這樣會(huì)好很多
4.裂解液是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中zui關(guān)鍵的因素，裂解液zui終使用時(shí)必須是澄清沒(méi)有任何沉渣的，如果沒(méi)有溶解好是肯定影響實(shí)驗(yàn)的，如果常溫不容易溶解的話可以放入4℃冰箱中一段時(shí)間，就比較容易溶解了
小結(jié)：本實(shí)驗(yàn)所有操作步驟從膠板制備開(kāi)始到zui后都應(yīng)該在暗光或者紅光下操作，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是凝膠制備，一定要均勻平整無(wú)氣泡，此外要避免試驗(yàn)中細(xì)胞裂解液等有毒物質(zhì)對(duì)自己的傷害
1、分離制備單細(xì)胞懸液：
（1）體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化，zui后用PBS懸浮吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞要計(jì)數(shù)，具體的量我前邊已經(jīng)說(shuō)過(guò)。
?。?）體內(nèi)臟器細(xì)胞：處死動(dòng)物，取出臟器，于Hanks’液中制備成單個(gè)細(xì)胞懸液。
2、膠板制備：
（1）取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。蓋玻片推勻，不能有氣泡，4度凝固5至8分鐘。
?。?）水平取下蓋片，取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細(xì)胞懸液（約400個(gè)細(xì)胞）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4度凝固5至8分鐘。
3、細(xì)胞裂解與電泳：
（1）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小時(shí)。
（2）取出膠板，用雙蒸水浸沒(méi)漂洗后放入電泳槽中，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。
?。?）玻片水平放置陽(yáng)附近，4℃電泳20到25分鐘（25V，300mA）。可在電泳槽周圍加冰塊以保持低溫。
4、中和與染色：
?。?）電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中，每次10分鐘，共中和3次，每次要更換中和液。zui后晾干。
?。?）取出膠板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗處染色5到10分鐘。
?。?）蒸餾水漂洗2次，每次5分鐘。
稍晾干，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察。
注意事項(xiàng)：
1.細(xì)胞一定要消化成單個(gè)的，如果你養(yǎng)的細(xì)胞是懸浮生長(zhǎng)的，或者形狀是圓形的（例如hela），那么你可以直接用細(xì)胞刮收細(xì)胞做，否則，如果細(xì)胞是非圓形的，例如成纖維細(xì)胞等，一定要用胰酶消化，使之成圓形，然后才可做實(shí)驗(yàn)。很多做彗星實(shí)驗(yàn)總是出不來(lái)結(jié)果的，可以考慮下是否是這方面的原因。
2.電泳時(shí)，電流與電壓強(qiáng)度在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)要恒定（例如：20V，200mA恒定），這樣出來(lái)的慧尾才有分析價(jià)值，否則你不知道分析因素的差異是由電泳條件的改變引起的還是細(xì)胞處理不同引起的。
3.關(guān)于掉膠的問(wèn)題：蓋玻片兩面都涂上剝離硅烷（挺便宜的一大瓶，但是有毒），這樣會(huì)好很多
4.裂解液是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中zui關(guān)鍵的因素，裂解液zui終使用時(shí)必須是澄清沒(méi)有任何沉渣的，如果沒(méi)有溶解好是肯定影響實(shí)驗(yàn)的，如果常溫不容易溶解的話可以放入4℃冰箱中一段時(shí)間，就比較容易溶解了
小結(jié)：本實(shí)驗(yàn)所有操作步驟從膠板制備開(kāi)始到zui后都應(yīng)該在暗光或者紅光下操作，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是凝膠制備，一定要均勻平整無(wú)氣泡，此外要避免試驗(yàn)中細(xì)胞裂解液等有毒物質(zhì)對(duì)自己的傷害