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細胞周期檢測染料:
可用于細胞周期檢測的熒光染料有碘化丙啶(Propidium,簡稱PI)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,簡稱DAPI)、Hochest、7氨基放線菌素(7-Amino-ActinomycinD,簡稱7AAD)等。
細胞周期PI法原理:
PI法是較常見的一種周期檢測方法。PI是一種雙鏈DNA的熒光染料,與雙鏈DNA結(jié)合后可產(chǎn)生熒光,并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞內(nèi)的DNA被PI染色后,可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定,然后根據(jù)DNA含量的分布情況,可進行細胞周期分析。PI染色后,假設G0/G1期細胞的熒光強度為1,那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2,正在進行DNA復制的S期細胞的熒光強度為1-2之間。
細胞周期檢測步驟:
1. 細胞樣品的準備:
收集細胞,用1ml預冷PBS洗1遍,輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,避免細胞成團。
2. 細胞固定:
加入1ml預冷的70%乙醇中,輕輕吹打混勻,4度固定2小時或更長時間(固定12-24小時可能效果更佳)。1000g離心3-5分鐘,沉淀細胞(如果細胞沉淀不充分,可以適當延長離心時間或加大離心力)。棄上清,用用1ml預冷PBS洗1遍。
3. PI染色:
每個樣品用0.5ml染色緩沖液(或PBS)重懸,加入25ul PI染色液(20×)、10ul RNase A(50×)。37度避光溫浴30分鐘。
4. 流式檢測:
用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光,同時檢測光散射情況。采用分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。
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