抗體標(biāo)記主要有標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、同位素標(biāo)記、標(biāo)記等，還有一些其他的標(biāo)記方法例如金標(biāo)記，講述了這些抗體標(biāo)記的基本原理、操作步驟。

　　一、標(biāo)記

　　1、辣根過(guò)氧化物(HRP)標(biāo)記
 

　　辣根過(guò)氧化物(HRP)標(biāo)記單抗和多克隆抗體的方法是過(guò)碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過(guò)碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結(jié)合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過(guò)碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用試劑穩(wěn)定Schiff氏堿。這里介紹兩種程序。

　　程序一：

　　(1)將5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時(shí)。

　　(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混勻。

　　(3)加入0.75ml小鼠已處理的，或純化單抗等(15mg/ml)，混勻。

　　(4)稱(chēng)取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi);隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套;蓋緊，室溫作用(避光)3小時(shí)或4℃過(guò)夜。

　　(5)用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘;再加入3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(shí)(或4℃過(guò)夜)。

　　(6)將交聯(lián)物過(guò)Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)層析純化。

　　(7)結(jié)合物質(zhì)量鑒定：

　　克分子比值測(cè)定

　　量(mg/ml)=OD403×0.4

　　IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62

　　克分子比值(E/P)=量×4/IgG量，一般在1-2之間。結(jié)合率=量×體積/抗體，標(biāo)記率一般為0.3-0.6，即1-2個(gè)HRP分子結(jié)合在一個(gè)抗體分子上，標(biāo)記率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4時(shí)，E/P約為1。

　　標(biāo)記率=OD403/OD280

　　活性和抗體活性的測(cè)定可應(yīng)用ELISA法、擴(kuò)散、DAB-H2O2顯色反應(yīng)測(cè)定結(jié)合物的活性，抗體活性及效價(jià)、特異性。

　　(8)HRP抗體結(jié)合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝-20℃存放，防止反復(fù)凍融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚，否則會(huì)影響活性。時(shí)凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護(hù)劑。

　　程序二：

　　(1)將5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯無(wú)水乙醇溶液0.1ml，室溫?cái)嚢枳饔?小時(shí)，以封閉HRP分子上的α和ε氨基。

　　(2)再加1ml 0.06mol/L 過(guò)碘酸鈉溶液，在室溫中避光輕攪30分鐘，溶液呈黃綠色;隨后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，輕攪1小時(shí)，中止氧化反應(yīng)。

　　(3)移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸鹽緩沖液中，4℃透析過(guò)夜，換三次緩沖液，注意避光。

　　(4)吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫輕攪2-3小時(shí)，避光;加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小時(shí)或過(guò)夜，或換用乙醇胺(2mol/L PH9.5)0.2ml，作用7小時(shí)。

　　(5)再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小時(shí)，換三次緩沖液。

　　(6)用3000r/min離心30分鐘，除去沉淀物。上清液再用半飽和硫酸銨鹽析三次，沉淀用少許PBS溶解，透析或?qū)游龀}，時(shí)進(jìn)一步層析純化。

　　(7)、(8)步驟同程序一。
 

　　2、堿性磷酸(AP)標(biāo)記

　　堿性磷酸(AP)用于標(biāo)記抗體，戊二醛一步法，將和單抗混合，再加入適量戊二醛，使和抗體蛋白的NH2分別與兩個(gè)醛基結(jié)合，制備成結(jié)合物。該法，但所得產(chǎn)物不均一，抗體活性損失大，標(biāo)記率低。其程序如下：

　　(1)將5mg AP加入1ml抗體溶液(2mg/ml)中溶解，裝入透析袋，于4℃對(duì)0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小時(shí)，換液三次。

　　(2)加入2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時(shí)，4℃對(duì)PBS透析過(guò)夜，其間換液三次。

　　(3)換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩沖液透析，4℃過(guò)夜，換液三次。

　　(4)取出標(biāo)記抗體，用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AP標(biāo)記物原液。

　　(5)每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存?zhèn)溆谩?/p>

　　3、PAP、APAAP的制備

　　PAP(過(guò)氧化物-抗過(guò)氧化物橋聯(lián)標(biāo)技術(shù))、APAAP(堿性磷酸-抗堿性磷酸橋聯(lián)標(biāo)技術(shù))的制備對(duì)于日益使用單抗的化學(xué)有意義?，F(xiàn)在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊和兔PAP、APAAP試劑供應(yīng)，只要配以相應(yīng)的橋抗體，即可便利地應(yīng)用單抗。因?yàn)镻AP法和APAAP法不用化學(xué)交聯(lián)劑處理和抗體，它們的活性均不受化學(xué)因素的影響，提了性和特異性。PAP和APAAP試劑的制備方法常采用先將HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或單抗中而獲得沉淀物，再加入鹽水，過(guò)量的有助于沉淀物的解離反應(yīng)，調(diào)PH至2.3，隨后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半飽和硫酸銨，純化PAP或APAAP。

　　根據(jù)需要還可將PAP和APAAP試劑先與相應(yīng)橋抗體結(jié)合后，再與特定單抗組成完整的試劑，這樣，單抗即可一步法用于或檢測(cè)試驗(yàn)等。

　　二、熒光素標(biāo)記

　　1、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記

　　FITC標(biāo)記抗體的原理是在堿性條件下，F(xiàn)ITC 的異硫氰基能與IgG的自由氨基結(jié)合，形成IgG與熒光素的結(jié)合

物。FITC是的熒光素，其次選用TRITC(四甲基異硫氰酸羅丹明)。FITC和TRITC是的雙標(biāo)記組合。其標(biāo)記步驟如下：

　　(1)以碳酸鹽緩沖液(PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸餾水1000ml)調(diào)整抗體濃度至10mg/ml。

　　(2)取5ml抗體溶液置于10ml小燒杯中。

　　(3)稱(chēng)取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內(nèi)，邊加邊輕攪;其后室溫避光作用2小時(shí)。

　　(4)將交聯(lián)物經(jīng)Sephadex G25或G50柱層析除去游離的熒光素。

　　(5)FITC的結(jié)合物質(zhì)量鑒定

　　IgG量(mg/ml)=(OD280-OD495×0.35)/1.4

　　F/P=2.87×OD495/(OD280-OD495×0.35)，一般說(shuō)，F(xiàn)ITC對(duì)抗體的摩爾比為3：1時(shí)適合于組織切片染色，為5-6：1時(shí)適合于懸液染色。以標(biāo)記抗體染色抗原，測(cè)定其特異性染色滴度和非特異染色的程度。

　　(6)標(biāo)記抗體的保存：宜保存于4℃，加NaN3。

　　2、異硫氰酸羅丹明(TRITC)標(biāo)記： 基本與FITC標(biāo)記相同。

　　三、同位素標(biāo)記

　　調(diào)的是在使用同位素標(biāo)記單抗或其他蛋白之前，應(yīng)掌握同位素操作和防護(hù)知識(shí)。正常情況下應(yīng)包括避免物理的接觸和對(duì)γ-射線(xiàn)照射的保護(hù)，操作和使用同位素標(biāo)記抗體時(shí)，應(yīng)利用防護(hù)裝置，并合理處置含放射性的廢料。

　　1、碘標(biāo)記

　　用碘標(biāo)記抗體是一種的標(biāo)記方法。125I衰變產(chǎn)生的γ和χ射線(xiàn)，很容易被檢測(cè)出來(lái)，而其60天的半衰期足夠的使用期，且能很地處理放射廢料。的碘標(biāo)記方法是氯胺T法，即將氧化劑氯胺T加入到抗體和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I轉(zhuǎn)化成I2，游離I2可與抗體分子中酪氨酸和一些組氨酸發(fā)生鹵化反應(yīng)，用還原劑和游離酪氨酸終止反應(yīng)，經(jīng)凝膠過(guò)濾將標(biāo)記的抗體與碘化酪氨酸及還原劑分離開(kāi)。其主要操作步驟如下：

　　(1)在進(jìn)行標(biāo)記之前，先選用截流分子量為20000-50000的凝膠，制備1ml凝膠柱，然后分別用10倍體積的1%BSA/PBS/0.02%疊氮鈉和PBS洗滌柱體，封住柱下口，備用。

　　(2)加入10ug純化單抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸鈉(PH7.5)的1.5ml指形管內(nèi)。隨后，加入500uCi Na125I混勻。

　　(3)加入25ul配制的2mg/ml氯胺T。室溫放置60秒。再加入50ul氯胺T終止液(含2.4mg/ml偏重亞硫酸鈉，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%環(huán)乙烷酰二甲苯的PBS)。

　　(4)將上述碘標(biāo)記物上樣在凝膠柱表面，小心放開(kāi)柱體下口，用1.5ml指形管收集。當(dāng)?shù)鈽?biāo)記物全部進(jìn)入柱體，加入0.3ml含0.03%疊氮鈉的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重復(fù)進(jìn)行，同時(shí)用同位素檢測(cè)儀測(cè)定標(biāo)記與未標(biāo)記的單抗。標(biāo)記抗體大約在至第四管出現(xiàn)。無(wú)害化處理柱子和非單抗標(biāo)記部分。

　　(5)將標(biāo)記單抗保存于4℃可使用6周時(shí)間。

　　2、生物法標(biāo)記

　　將雜交培養(yǎng)在含有放射性前體的培養(yǎng)基中，隨著抗體分子的、組裝，同位素會(huì)標(biāo)記在抗體分子的初級(jí)氨基酸鏈上，本方法不會(huì)導(dǎo)致抗體活性的喪失。其主要步驟是：

　　(1)離心收集處于對(duì)數(shù)生的雜交，約需2×106個(gè)。以預(yù)熱37℃不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基洗滌上述。

　　(2)用含2% PBS不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基懸浮雜交至106個(gè)/ml，加入35S甲硫氨酸(每次加入100uCi可產(chǎn)生105-106cpm的抗體)。

　　(3)經(jīng)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，離心后，吸出培養(yǎng)上清，分別加入1/20體積的1mol/L Tris(PH8.0)及疊氮鈉至濃度0.02%。該標(biāo)記抗體可按純化單抗方法進(jìn)行。

　　四、標(biāo)記

　　標(biāo)記反應(yīng)琥珀酰亞胺酯進(jìn)行。是與抗體分子的游離賴(lài)氨酸等發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而完成標(biāo)記。其主要步驟是：

　　1、用二甲基亞砜配制10mg/ml的N-羥琥珀酰亞胺(應(yīng)根據(jù)需要選用不同大小和間臂長(zhǎng)的化琥珀酰酯)。

　　2、用硼酸鈉緩沖液(0.1mol/L，PH8.0)稀釋單抗溶液至1-3mg/ml。

　　3、每毫克抗體加入25-250ug的酯，混勻后，室溫作用4小時(shí)。

　　4、按每250ug酯加入20ul 1mol/L NH4Cl終止反應(yīng)，室溫放置10分鐘。

　　5、以PBS充分透析除去游離，標(biāo)記抗體凍存。

　　五、其他標(biāo)記技術(shù)

　　適用于蛋白質(zhì)的其他標(biāo)記方法也可用于單抗，如金標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、SPA標(biāo)記、鐵蛋白標(biāo)記等。

　　標(biāo)記是一種、靈敏度的技術(shù)，主要原理是級(jí)聯(lián)方法效應(yīng)。單抗已經(jīng)用于等，主要是利用單抗標(biāo)記的試劑盒進(jìn)行的。