小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品：大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6（種屬鑒定）Brevibacillus agri土壤短芽孢桿菌人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞Caki-2(STR鑒定正確)Brevibacillus centrosporus中孢短芽孢桿菌狗腎細(xì)胞Super Tube（種屬鑒定）Brevibacillus formosus美麗短芽孢桿菌男性正常龜頭細(xì)胞系HS68Brevibacillus reuszer

一、細(xì)胞基本屬性：

 

包被條件： 

培養(yǎng)基：含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺(tái)中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

原代細(xì)胞使用方法：

是一種貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈內(nèi)皮細(xì)胞樣，在技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下，細(xì)胞可傳2-3代；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

客戶收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基。

3. 細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液，1000rpm，離心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm，離心5min，丟棄上清，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

5)原瓶?jī)?nèi)貼壁細(xì)胞按正常消化處理。

4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

因原代細(xì)胞貼壁特殊性，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時(shí)，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被，以增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性，避免細(xì)胞因沒(méi)貼好影響實(shí)驗(yàn)；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%），依據(jù)細(xì)胞種類而定。懸浮/半懸浮細(xì)胞無(wú)需包被。
公司正在出售的產(chǎn)品：
缺氧誘導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的人乳腺癌細(xì)胞；MDA-MB-231-hiGFP-10C

缺氧誘導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠乳腺癌細(xì)胞；Ca761-hiGFP-3C
缺氧誘導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠乳腺癌細(xì)胞；Ca761-hiGFP-1C2
表達(dá)人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人乳腺癌細(xì)胞；MCF7-bFGF-EGFP
表達(dá)人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的小鼠乳腺癌細(xì)胞；Ca761-bFGF-EGFP
綠色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠乳腺癌細(xì)胞；Ca761-EGFP
表達(dá)人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人乳腺癌細(xì)胞；MDA-MB-231-bFGF-EGFP
紅色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠宮頸癌細(xì)胞；U14-RFP
綠色熒光蛋白標(biāo)記的人結(jié)腸癌細(xì)胞；HCT116-CFP
綠色熒光蛋白標(biāo)記的人乳腺癌細(xì)胞；MCF7-EGFP
綠色熒光蛋白標(biāo)記的人胚腎細(xì)胞；293T-EGFP
紅色熒光蛋白標(biāo)記的人胚腎細(xì)胞；293T-tdT
紅色熒光蛋白和螢光素酶標(biāo)記的人胚腎細(xì)胞；293T-Luc2-tdT
紅色熒光蛋白標(biāo)記的人胚腎細(xì)胞；293T-mCherry
紅色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠黑色素瘤細(xì)胞；B16-F10-tdT
photobacterium Medium
產(chǎn)組胺菌培養(yǎng)基
Histamine producing bacteria Medium
脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂
SkimMilkSucroseCaseinDigest Agar Medium
BSSA瓊脂培養(yǎng)基
BSSA agar medium
革蘭氏陰性菌（G-）選擇性培養(yǎng)基
Gram Negative Bacteria Selective Medium
幽門螺旋桿菌固體培養(yǎng)基
小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞Helicobacter Pylori Medium
幽門螺旋桿菌培養(yǎng)基（液體）
Helicobacter Pylori Medium
M1培養(yǎng)基
M1 Medium