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       酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。它是應(yīng)用最多的一種免疫酶技術(shù)。

      ELISA 測(cè)定的陽(yáng)性判斷值, 通常是將大量陰性和陽(yáng)性人群的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后確定的, 其確定依據(jù)為判斷結(jié)果的假陽(yáng)性和假陰性率最di。在陽(yáng)性判斷值周圍一定范圍內(nèi)之外的測(cè)定結(jié)果可歸為可疑, 亦即ELISA 測(cè)定的“灰區(qū)"?！盎覅^(qū)"的大小可用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定。測(cè)定結(jié)果處于“灰區(qū)"的樣本, 可通過(guò)確認(rèn)試驗(yàn)或追蹤檢測(cè)來(lái)確定到底是陽(yáng)性還是陰性ELISA“灰區(qū)"是把定量分析的正常值范圍引入定性分析而建立的概念?；覅^(qū)的設(shè)置有二種: (1)CO × (1±C) , C 為該試劑的批內(nèi)C (一般在15%～ 20% 間) ; (2)CO ±2S, S 為做室內(nèi)ROC 的S。

  

      另外, 個(gè)人認(rèn)為: ELISA“灰區(qū)"對(duì)于不同項(xiàng)目和應(yīng)用的領(lǐng)域不同, 其設(shè)置不能一概而論。根據(jù)美國(guó)疾病控制中心 (CDC) 對(duì)美國(guó)Ortho 的抗HC 檢測(cè)的ELISA 試劑盒進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)只有檢驗(yàn)結(jié)果S/CO ≥318 時(shí), 高度預(yù)示HC 抗體真陽(yáng)性狀態(tài); 若檢驗(yàn)結(jié)果S/CO < 318, 存在較高的假陽(yáng)性。在血站系統(tǒng)的獻(xiàn)血員抗HC 篩查用上述兩種灰區(qū)的設(shè)置方法沒(méi)有什么不可; 如果臨床實(shí)驗(yàn)室抗HC 的灰區(qū)也按前者設(shè)置,勢(shì)必存在較多的假陽(yáng)性。ELISA 質(zhì)量保證是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程, 許多重要的環(huán)節(jié)都影響到檢測(cè)的質(zhì)量?，F(xiàn)分析如下。

 

1 、方法學(xué)的影響

        ELISA 測(cè)定模式包括以下幾種: 雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM 抗體捕捉法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法, 其中競(jìng)爭(zhēng)抑制法因受操作時(shí)差所引起的bu 公平競(jìng)爭(zhēng)等因素的影響, 結(jié)果重復(fù)性較差, 質(zhì)量較難控制。

 

2 、試劑因素

       試劑的選擇　檢測(cè)的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。由于該反應(yīng)過(guò)程受多種因素的影響, 如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等, 因而檢測(cè)結(jié)果難以溯源, 不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號(hào)間結(jié)果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測(cè)的水平, 因此在引入新項(xiàng)目之前必須對(duì)試劑進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)估。試劑的評(píng)估有以下幾個(gè)步驟: (1) 確定開(kāi)展該項(xiàng)目的必要性; (2) 了解該項(xiàng)目現(xiàn)有的檢測(cè)方法和原理; (3) 在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較,判斷標(biāo)準(zhǔn)shou 選參考方法或參考物質(zhì), 其次為臨床的滿意度及權(quán)wei 機(jī)構(gòu)的報(bào)告如各級(jí)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)、CDC 報(bào)告等; (4) 定期對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認(rèn)可該試劑。

 

3、樣本因素

      標(biāo)本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素,前者包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、自身抗體、溶菌酶等, 后者包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、標(biāo)本凝固不全、冷凍標(biāo)本的反復(fù)凍融等。其中外源性干擾因素是我們?cè)跈z測(cè)過(guò)程中可以避免也是必須避免的因素, 而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過(guò)選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見(jiàn)的疑難病例時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對(duì)外源性干擾因素進(jìn)行簡(jiǎn)要說(shuō)明:

 

      標(biāo)本溶血　要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán), 其具有類過(guò)氧化物的活性, 因此, 在以辣根過(guò)氧化物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 為標(biāo)記酶的ELISA 測(cè)定中, 如果血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高, 則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相, 從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色。

 

4、操作因素對(duì)ELISA 結(jié)果的影響

       ELISA 測(cè)定一般遵循以下步驟: 固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結(jié)合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色。

       目前各種形式的ELISA 自動(dòng)分析儀已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng), 如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動(dòng)酶免分析儀, 其試劑為開(kāi)放式的, 而對(duì)于其它類型的, 則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室均采用手工操作加儀器測(cè)定的方式。ELISA 操作步驟復(fù)雜, 操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個(gè)步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具, 其在長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)會(huì)因機(jī)械磨損或者推動(dòng)桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn), 尤其是對(duì)于樣本量較大的臨床實(shí)驗(yàn)室, 因此必須定期對(duì)加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本時(shí)均需更換吸嘴, 以免發(fā)生交叉污染。加樣時(shí)速度不可太快, 避免將標(biāo)本加在孔壁上部, 并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)還應(yīng)當(dāng)注意操作時(shí)差對(duì)結(jié)果的影響, 操作時(shí)差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時(shí)間的差異。操作時(shí)差在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都存在, 尤其是手工操作, 日常檢測(cè)標(biāo)本多達(dá)幾百個(gè),從加入第一個(gè)標(biāo)本到最后一個(gè)標(biāo)本, 需幾十分鐘, 加入試劑及混勻等均存在著前后時(shí)間差異, 使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時(shí)間不一致, 操作時(shí)差對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的結(jié)果影響更大, 在加酶結(jié)合物和底物時(shí)可用定量多道。