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技術(shù)文章

ELISA試劑盒中HRP底物使用操作步驟

閱讀:102          發(fā)布時(shí)間:2024-7-15

       ELISA試劑盒中HRP底物范圍較廣,HRP即辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase)比活性高,穩(wěn)定,分子量小,純酶容易制備,所以zui 常用。過(guò)氧化物酶作為多個(gè)試劑盒顯色體系的關(guān)鍵成分,對(duì)試劑盒的質(zhì)量有重要影響。HRP底物主要包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。


一、二氨基聯(lián)苯胺/金屬鹽

DAB是辣根過(guò)氧化物酶最敏感、常用的底物。它產(chǎn)生強(qiáng)烈的棕色產(chǎn)物,在水和醇中不溶解。多數(shù)情況下,推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當(dāng)加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中,辣根過(guò)氧化物酶可以更加敏感。此類(lèi)反應(yīng)產(chǎn)物呈暗藍(lán)灰色至黑色,且在水及醇中穩(wěn)定。DAB/金屬鹽染色應(yīng)用的組織染色范圍較廣。

1.     需要的溶液和特殊設(shè)備

DAB,0.05 mol/LTris緩沖液(pH7.6), 0.3% (W/V) 氯化鎳/水貯存液, 30%過(guò)氧化氫, DPX, 光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果).

2.     操作步驟

(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris緩沖液(pH7.6)溶解6 mg DAB;

(2) 加 l mL 0.3%(W/V)氯化鎳/水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代);

(3) 加0.1 mL 3%過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫一般以30%的溶液提供,貯存在4 ℃,此條件可以持續(xù)1個(gè)月;

(4) 如果出現(xiàn)沉淀,用濾紙過(guò)濾;

(5) 加此溶液至標(biāo)本,并孵育1~20 min水洗終止反應(yīng);

(6) 優(yōu)化:如果需要可復(fù)染;

(7) 用DPX封片。

 

二、氯萘酚

氯萘酚可以形成一種藍(lán)黑色產(chǎn)物。敏感性低于DAB,且產(chǎn)物可溶于醇中。它適用于當(dāng)DAB反應(yīng)形成較高背景或要求改變產(chǎn)物的顏色。

1.     需要的溶液和特殊設(shè)備

0.03%氯萘酚,用無(wú)水乙醇溶解(貯存在-20℃),0.05 mol/LTris(pH7.6),過(guò)氧化氫,Gelvatol或者M(jìn)owiol,光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)。

2.     操作步驟

(1) 氯萘酚貯存液的準(zhǔn)備:用10 mL無(wú)水乙醇溶解0.3 g氯萘酚,貯存于-20℃;

(2) 加100 μL 氯萘酚貯存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6);

(3) 加0.1 mL 3%過(guò)氧化氫于水中。過(guò)氧化氫一般是以30%的溶液提供,4℃可存放1個(gè)月;

(4) 白色沉淀可用濾紙過(guò)濾去除;

(5) 加此溶液到標(biāo)本中,并在室溫孵育10~40 min,水洗終止反應(yīng);

(6) 優(yōu)化:如果需要,進(jìn)行復(fù)染,但只可使用水溶性染料;

(7) 用Gelvatol或者M(jìn)owiol封片。

 

三、氨乙基咔唑

氨乙基咔唑(AEC)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物,其敏感性低于DAB,但可用于DAB反應(yīng)產(chǎn)生較高背景或要求改變產(chǎn)物顏色的實(shí)驗(yàn)。此產(chǎn)物可溶于醇,但不溶于水。

1.     需要的溶液和特殊設(shè)備

0.4% AEC用 N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解, 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.2),過(guò)氧化氫, Gelvatol或Mowiol,光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)。

2.     操作步驟

(1) 用 l mL DMF溶解 4 mg AEC。AEC在DMF中穩(wěn)定,因此,可以用100 mL DMF溶解0.4 g AEC作為貯存液備用;

(2) 加 l mL AEC溶液至15 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.2)中,并攪拌;

(3) 加0.15 mL 3%過(guò)氧化氫于水中。過(guò)氧化氫一般是30%的溶液提供,在4℃可存放1個(gè)月;

(4) 用濾紙過(guò)濾;

(5) 加此溶液到標(biāo)本中,并于室溫孵育10~40 min,水洗終止反應(yīng);

(6) 優(yōu)化:如果需要復(fù)染,只可用水溶性染料;

(7) 用Gelvatol或Mowiol封片。

 


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