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 原脫植基葉綠素（PCHLIDE）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒

使用說明書

（本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!）

聲明：尊敬的客戶，感謝您選用本公司的產(chǎn)品。本產(chǎn)品適用于體外定量檢測血清、血漿或其 它相關生物液體中天然和重組 原脫植基葉綠素（PCHLIDE） 濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分！

試劑盒組成：

特別說明：

*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整）

#:  一周內使用可存于4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃.

相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些，請在使用時量取而非直接倒出！

檢測原理: 本試劑盒采用競爭ELISA法。用原脫植基葉綠素（PCHLIDE）抗原包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品中的原脫植基葉綠素（PCHLIDE）與包 被的原脫植基葉綠素（PCHLIDE）競爭生物素標記的抗原脫植基葉綠素（PCHLIDE）單抗上的結合位點，游離的成分被洗去。加入辣根過氧化物 酶標記的親和素，生物素與親和素特異性結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色 底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm 波長處測OD值，原脫植基葉綠素（PCHLIDE）濃度與OD450值之間呈反比，通過繪制標準曲線計算出樣品中原脫植基葉綠素（PCHLIDE）的濃度。

樣品收集:

1.   血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過ye后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集 血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。

2.   血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可 檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。

3.   組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會 影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體

積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整，并做好記錄。 推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組 織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘， 取上清檢測。

4.   細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。

5.   其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測 具體處理方法可參考：

6.   樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7.   樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍 存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融。

8.   如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品zui高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋（建議先 做預實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。

試驗所需自備物品:

1.   酶標儀(450nm波長濾光片)

2.   高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.   37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4.   吸水紙

檢測前準備工作:

1.    請?zhí)崆?/span>20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.    將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結 晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超 過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用

3.    標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋， 靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為160pg/mL）。 然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。

4.    生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以50μL/孔計），實際配制時應多配

制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作 濃度。當日使用。

5.    酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制

100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。 當日使用。

洗滌方法:

1.    自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。

2.    手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸 去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。

操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.    加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕藴势?/span>&樣品稀釋液 50μL，余孔分 別加標準品或待測樣品 50μL，立即每孔加入配好的生物素化抗體工作液 50μL（在使用前

15 分鐘內配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕 晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育 45 分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新 的標準品溶液。

2.    棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL /每孔，甩干并在吸水紙 上輕拍將孔內液體拍干。

3.    每孔加酶結合物工作液（臨用前 15 分鐘內配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。

4.    棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。

5.    每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實際顯 se情 況酌情縮短或延長，但不可超過 30 分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止）。

6.    每孔加終止液 50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的

加入順序相同。

7.    立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。應提前打開酶標儀電源，預熱儀 器，設置好檢測程序。

8.    實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結束。

注意事項：

1.   保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強 光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結果。

2.   酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成 任何影響。暫時不用的板條應拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！

3.   加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間控制在

10分鐘內。推薦設置復孔。

4.   溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標 板處于干燥狀態(tài)；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

5.   洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸

水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數(shù)。

6.   試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小， 運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用前1000轉/分離心1min，以使附著管壁或瓶蓋的 液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、生物素化抗體工 作液、酶結合物工作液請根據(jù)所需用量配制，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請 配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時， 一次不要小于10μL），以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標 準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次用量分 裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復凍融。

7.   顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很 明顯，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免顏色過深影響酶標儀讀數(shù)。

8.   底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

9.   混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量 振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

10. 安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品 時，請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。

11. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）

12. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結果！

結果判斷:

1.    以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。如有設置復孔，則應取其平均 值計算。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標， 標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。

2.    推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值， 由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程 式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

3.    若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。

靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性:

●靈敏度：zui小可測 2pg/mL。

●檢測范圍：2–85pg/mL。

● 特異性：可檢測重組或天然的 原脫植基葉綠素（PCHLIDE），且與其它相關蛋白無交叉反應。

● 重復性：板內，板間變異系數(shù)均<10%。

聲明

1.   限于現(xiàn)有條件及科學技術水平，尚不能對所有原料進行全面的鑒定分析，本產(chǎn)品可能存在 一定的質量技術風險。

2.   zui終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關，請務 必準備充足的待測樣品。

3.   只有全部使用試劑盒內的試劑才能保證檢測效果，不能混用其他商的產(chǎn)品。只有嚴格

遵守實驗說明才會得到*的檢測結果。

4.   有效期：6 個月。

5.   本操作說明同樣適用于 48T 試劑盒。